Chapitre 4 Flashcards
Avec les enzymes de restriction, quelle coupe forme des bouts collants?
Coupe cohésive
Quelles enzymes assurent la ligature (liaison) des fragments d’ADN avec bouts francs ou des bouts collants?
Les ligases
À quel endroit sur le brin d’ADN la ligase fait le lien covalent sur le brin d’ADN?
Entre le phosphate de l’extrémité 5’ et l’extrémité 3’
Quelles enzymes servent à enlever des groupes phosphates?
Phosphatase
Quelle est l’utilité des phosphatases?
Pour préparer de l’ADN recombinant et éviter la ligation des extrémités du vecteur.
Quelles enzymes se chargent d’ajouter des groupements phosphate?
Les kinases
Que sont les enzymes de restriction?
Ces enzymes sont capables de reconnaître une séquence particulière de bases azotées sur l’ADN, la séquence de reconnaissance. C’est un palindrome.
L’enzyme coupe l’ADN toujours au même endroit entre des bases bien déterminées de la séquence reconnue.
Les enzymes de restriction peuvent produire 2 types de coupe. Que sont-elles?
Les coupes franches et les coupes cohésives
QU’est-ce qu’une coupe franche?
Lorsque l’enzyme de restriction coupe la séquence d’ADN dans l’axe de symétrie.
Qu’est-ce qu’une coupe cohésive?
Lorsque l’enzyme coupe la molécule d’ADN à un endroit spécifique de la séquence de reconaissance en laissant sur la molécule des extrémités parfaitement complémentaires.
Quelle enzyme peut effectuer des ligatures sur des fragments d’ADN avec bouts francs ou des bouts collants?
Les ligases
Quel est le permier objectif du projet génome humain?
Obtenir la séquence complète du génome humain
Quel est le 2e objectif du projet génome humain?
Le séquençage du génome de différents organismes
Quel est le troisième objectif du projet génome humain?
Déposer les séquences dans des bases de données publiques
Quel est le 4e objectif du projet génome humain?
Attribuer une signification fonctionnelle à tous les gènes et aux autres renseignements biologiques importants encodés par l’ADN.
Quelles sont les 2 approches possibles pour séquencer des génomes complets de grande taille?
- L’approche du chromosome spécifique
- L’approche du génome entier
Qu’est-ce que l’approche du chromosome spécifique?
Ordonner les clones issus d’un chromosome spécifique.
Qu’est-ce que l’approche du génome entier?
Découper tout le génome et ordonner les fragments ensuite
Qu’est-ce qu’un vecteur?
Construction moléculaire (molécule d’ADN) dans laquelle il est possible d’insérer des fragments d’acide nucléique étranger.
Qu’est-ce qu’une banque de clones?
Un ensemble de cellules portant des fragments d’ADN
Quels sont les principaux vecteurs de clonage bactérien?
Les plasmides et les BAC (chromosome bactérien artificiel)
À quoi sert le vecteur?
Le vecteur assure le maintien, la réplication et l’expression du fragment d’ADN qu’il porte.
Qu’est-ce qu’une banque génomique?
un ensemble de clones couvrant tout le génome d’une espèce
Pour les humains, est-il plus avantageux d’utiliser des CBA ou des banques de clones plasmidiques?
CBA (clone de chromosome bactérien artificiel), car il a plus de paires de bases, ce qui ressemble davantage à l’humain qui a un grand génome.
Qu’est-ce que le pUC19?
Un vecteur de clonage, c’est-à-dire un vecteur plasmidique servant à effectuer un clonage de gènes dans la bactérie E. Coli.
Que permet l’origine de réplication ori?
Permet de se répliquer de manière autonome.
Quels gènes du plasmide pUC19 servent de marqueurs?
Le gène codant pour la résistance l’ampiciline et l’autre lacZ, codant pour une enzyme la B-galactosidase.
VRAI OU FAUX?
Le SCM empêche la transcription de l’ADN où il est inséré.
FAUX
Il n’empêche pas la transcription.
Dans quels sites du plasmide l’ADN étranger peut être inséré ?
Dans les sites de l’enzyme de restriction.
Qu’est-ce qui est représenté sur l’image?
Quelle est la fonction des marqueurs pour la sélection?
Ces séquences permettent de sélectionner les cellules qui contiennent le vecteur
Les marqueurs pour la sélection sont des séquences qui permettent de sélectionner les cellules qui contiennent le vecteur.
Il en existe 2 types, que sont-ils?
Gènes de résistance aux antibiotiques
Gènes auxotrophiques
À quoi servent les gènes de résistances dans les marqueurs pour la sélection?
Permet à la cellule de détoxifier un produit ajouté au milieu qui normalement tue la cellule.
À quoi servent les marqueurs auxotrophiques chez les marqueurs pour la sélection?
Permettent à la cellule de synthétiser un composé essentiel (généralement un acide aminé) dans un milieu qui en est dépourvu.
Pour quoi code ce gène?
Code pour la résistance à l’ampiciline, un antibiotique.
On dira d’une cellule qu’elle a subi la transformation lorsque …
Un gène étranger a été incorporé dans la cellule.
Lors de la transformation, qu’est-ce qui favorise le passage de l’ADN à travers les canaux membranaires?
Les changes + des ions CaCl2 et le choc thermique
Quelle bactérie et la plus utilisée en génie génétique?
E. Coli
Que faut-il faire pour conserver un plasmide?
- insère dans une bactérie
- Croissance de la bactérie
- Congélation à -80ºC dans du glycol
Pourquoi les colonies contenant des plasmides recombinés sont blanches?
Car elles ne peuvent pas hydrolyser le X-gal, leur gène lacZ est interrompu
Pourquoi les colonies qui renferment un plasmide non recombiné sont bleues?
Parce qu’elles peuvent hydrolyser le X-gal, leur gène lacZ est intact
Les plasmides utilisés afin d’améliorer les plantes en leur conférant une résistance aux insectes ou aux herbicides sont des dérivés du …
Plasmide Ti
Quelle est la fonction du plasmide Ti?
Production de tumeurs
Pour quoi code le gène ADN-T sur le plasmide Ti?
Code pour plusieurs fonctions intéressantes qui contribuent à la capacité de la bactérie de croître et de se diviser à l’intérieur de la cellule végétale.
Quelle bactérie est liée au plasmide Ti?
Agrobacterium tumefaciens
Quel plasmide est utilisé dans la modification génétique des végétaux?
Plasmide Ti
Quelle est la modification approtée au maïs?
Résistance aux insectes
Quelle est la source du gène de l’OGM du maïs?
Bacillus thuringiensis
Quel est le but des OMG du maïs?
Réduction des dégâts causés par les insectes
Quels sont les principaux bénéficiaires des OGM du maïs?
Agriculteurs
Qu’est-ce qui est impliqué dans le séquençage complet du génome humain?
- Situer l’ordre complet des nucléotides sur chaque chormosome
- Connaître toutes les mutations (allèles) du génome humain
Quel est l’objectif ultime du projet génome humain?
Attribuer une signification fonctionnelle à tous les gènes et aux autres renseignements biologiques importants encodés par l’ADN de notre génome.
Qu’est-ce qu’une banque de clones génomique?
Une collection complète de fragments d’ADN d’une espèce, insérés dans différents vecteurs.
Comment est réalisé un criblage?
En utilisant une sonde spécifique qui trouvera et signalera le clone que le chercheur veut identifier.
Qu’est-ce qu’une banque d’ADNc?
Un ensemble de séquences d’ADNc produites à partir de l’ARNm mature obtenu suite à la transcription chez une cellule eucaryote.
Donner la définition du criblage moléculaire.
Méthode permettant de rechercher facilement un gène d’intérêt dans une banque d’ADN génomique, notamment à l’aide de techniques d’hybridation moléculaire avec une sonde marquée et complémentaire au gène recherché.
Quelle est la technique de l’hybridation moléculaire, servant au criblage moléculaire?
Technique basée sur le principe de la complémentarité entre fragments d’ADN, où on va chercher le fragment en utilisant une sonde complémentaire de la séquence recherchée.
Lors de la fabrication de l’ADNc, qu’est-ce qui sert d’amorce à la réverse transcriptase?
Oligo-dT, va s’hybrider avec la queue poly-A des ARNm
Avec quelle partie des ARNm le court oligonuléotide de thymine (oligo-dT) s’hybride?
La queue poly-A
Que doit-on fournir à la réverse trancriptase pour fabriquer le brin d’ADN à partir d’un brin d’ARN?
Les dNTP des tous types en concentrations suffisantes
Lors de la fabrication d’ADNc, qu’est-ce qui sert d’amorce à l’ADN polymérase I?
La boucle en épingle à cheveux
Lors de la fabrication d’ADNc, quelle enzyme détruit la portion simple brin de la molécule d’ADN?
Nucléase SI
Quels sont les avantages des banques d’ADNc?
- Plus petites, donc facilitent l’identification d’une protéine spécifique
- Correspond à la portion codante d’un gène puisqu’on utilise l’ARNm après épissage
Quelles sont les différences entre les banques génomiques et les banques d’ADNc?
- Le gène de la banque génomique est plus rarement transcrit
- Les gènes de l’ADNc ne contiennent pas d’introns
Donner les caractéristiques de la banque génomique que l’on peut tirer de l’image.
- Gènes A et B représentés de manière égale
- Contient des introns et de l’ADN non transcrit
- La plupart des clones ne contiennent qu’une partie de la séquence codante d’un gène.
Donner les caractéristiques de la banque d’ADNc que l’on peut tirer de cette image?
- Le gène A n’est pas souvent transcrit et il se retrouve donc en plus faible quantité dans la banque, contrairement au gène B
- Ne contient pas d’introns ni d’ADN non transcrit
- Contient uniquement les exons
Qu’est-ce qu’une sonde froide et une sonde chaude?
Sonde froide: Sonde fluorescente
Sonde chaude: Sonde radioactive
Quelle est la différence entre une molécule de dNTP et une molécule de ddNTP?
Les ddNTP ne possèdent pas de groupement OH
Quels sont les types de ddNTP?
ddATP, ddTTP, ddCTP, ddGTP
Est-ce que l’étape de l’autoradiographie est essentielle? Expliquer.
L’étape de l,autoradiographie n’est pas essentielle. Aucun film photographique n’est utilisé pour la technique avec la sonde fluorescente. On compare directement les colonies sur la boîte de pétri.
Quel matériel est utilisé pour l’étape de l’autoradiograohie?
Film photographique
Qu’est-ce qu’une sonde?
Fragment d’ADN ou d’ARN simple brin dont la séquence est complémentaire de la séquence recherchée.
Par incorporation de quelle substance on pourra déceler une sonde par hybridation?
Isotope radioactif (sonde chaude) Marqueur froid, non-radioactif; fluorescent
Qu’est-ce que l’autoradiographie?
Technique d’imagerie d’émission réalisée à partir d’une source radioactive placée au contact d’une émulsion ou d’un film photographique
Donner la définition de criblage moléculaire.
Méthode permettant de rechercher facilement un gène d’intérêt dans une banque d’ADN génomique, notamment à l’aide de techniques d’hybridation moléculaire avec une sonde marquée et complémentaire du gène recherché.
Quelle est la fonction du criblage moléculaire?
Permettre d’identifier la bactérie qui contient un gène donné.
Quelles sont les sources d’ADN pour la sonde?
- tissu qui exprime le gène d’intérêt
- organisme similaire dont le gène a été cloné
Comment peut-on savoir si deux organismes sont apparentés?
Deux organismes sont d’autant plus étroitement apparentés que le nombre d’appariement de brins d’ADN (hybridation) provenant de ces 2 organismes est élevé.
Qu’est-ce qu’une sonde d’ADN synthétique?
Sonde d’ADN synthétisée à partir de la conaissance des acides aminés d’une protéine produite par le gène + utilisation du code génétique.
Avec la technique de transfert Southern, l’ADN est d’abord coupé grâce à des enzymes de restrictions. Cette digestion de l’ADN génomique des eucaryotes produit parfois tellement de fragments que l’électrophorèse …
Ne présente qu’un trait continu d’ADN
Quel est le but d’avoir des sondes radioactives pour la technique de transfert Southern?
Retrouver le fragment dans l’amas de fragments sur le gel d’électrophorèse
Associer Western, Northern et Southern à leur molécule respective.
Southern: ADN
Northern: ARN
Western: Protéines
Quelle est l’utilité de la technique de transfert de Southern?
Dépistage de maladies génétiques comme la fibrose kystique, l’anémie falciforme et la chorée de Huntington
Pour la technique de transfert Western, qu’est-ce qu’on utilise au lieu des sondes?
On utilise des anticorps, qui sont complémentaires aux antigènes (protéines).
On appelle cette technique immunodétection.
À quoi servent les lavages dans le transfert Southern, apès l’hybridation avec la sonde?
Sert à enlever les sondes excédentaires, celles qui n,ont pas été appariées.
Dire en ordre les étapes du transfert Southern.
- Digestion de l’ADN génomique par les enzymes de restrictions
- Les fragments d’ADN sont placés dans les puits d’un gel
- Migration des fragments d’ADN
- Le gel est trempé dans une solution alcaline (soude)
- Buvardage sur une membrane de nitrocellulose
- Fixation de l’ADN sur la membrane de nitrocellulose par chauffage
- Hybridation avec des sondes spécifiques marquées
- Lavage et autoradiographie
Comment peut-on dépister l’anémie falciforme?
Dépistage par transfert southern
Lors du séquençage, combien d’amorces d’ADN sont nécessaires?
Une SEULE amorce d’ADN
Lors du séquençage, pourquoi les dNTP doivent être présents?
pour permettre la synthèse du brin complémentaire à la séquence normale.
Que sont les ddNTP?
dNTP modifiés par le retrait d’un atome d’oxygène qui permet la liaison au prochain nucléotide, donc son retrait fait en sorte que l’élongation s’arrête suite à l’incorporation d’un ddNTP.
Pourquoi le groupement OH des dNTP est essentiel pour effectuer l’élongation?
Car l’élongation se fait dans le sens 5’—>3’.
Les nouveaux nucléotides sont ajoutés à l’extrémité 3’-OH, car le OH est nécessaire pour faire la liaison phosphodiester.
(Pas à 5’-P car le phosphate est négatif).
Quels sont les avantages des séquenceurs automatiques?
- Gain de temps
- Coût est moindre (outre le coût d’achat élevé)
- Lire plusieurs centaines de nucléotides avec une très bonne qualité
Identifier les façons de séquencer le génome entier.
Qu’est-ce qu’un contig?
Une longue séquence génomique continue et ordonnée générée par l’assemblage des clones d’une bibliothèque génomique qui se chevauchent. Permet de reconstituer la totalité de la séquence d’un fragment d’ADN de départ.
Quelle est la fonction des contig?
Permet de reconstituer la totalité de la séquence d’un fragment d’ADN de départ.
Lors d’une ytransformation, quelles sont les deux choses qui favorisent le passage de l’ADN?
Le choc thermique et les charges + des ions calcium
Quel est le rôle des gènes de résistance aux antibiotiques retrouvés dans un vecteur?
Marqueur pour la sélection: permet de sélectionner les cellules qui contiennent le vecteur (plasmide). Un gène de résistance permet à la cellule de détoxifier un produit ajouté au milieu qui normalement tue la cellule.
De quelle bactérie provient le plasmide Ti?
Agrobacterium tumefaciens
Quel type de sondes utilisent l’autoradiographie?
Sondes radioactives
Quel type de sonde n’utilise pas l’étape de l’autoradiographie?
Qu’est-ce qui remplace cette étape?
Sonde fluorescente.
On compare directement la membrane avec les colonies sur la boîte de pétri
Quel type de sonde est déduit d’une séquence de protéines?
Sonde dégénérées
Pourquoi les sondes dégénérées sont appelées ainsi?
À cause de la dégénérescence du code génétique, un certain nombre de séquences nucléotidiques différentes sont possibles pour chaque séquence d’acides aminés.
Quels sont les avantages d’utiliser une banque génomique?
- Dépistage maladies génétiques
- Utile pour transfert de Southern
- Séquencage
- Criblage de la banque permet d’identifier un gène donné
Quels sont les avantages d’une banque d’ADNc?
- Plus petites et facilitent l’identification d’une protéine spécifique, surtout lorsqu’elle est fortement exprimée dans le tissu.
- Peut être insérée dans un vecteur d’expression et être exprimé directement dans la bactérie
- Séquencage pour identifier les acides aminés d’une protéine
Quelle est l’enzyme utilisée et le nom de la technique pour fabriquer de l’ADNc à partir de l’ARNm?
Enzyme: transcriptase inverse
Technique: RT-PCR
Quelle enzyme est utilisée pour effectuer une PCR?
Taq polymérase
Quelles sont les 3 étapes d’une PCR?
Décrire les 3 étapes.
- Dénaturation: les 2 brins d’ADN sont séparés
- Hybridation: 2 amorces complémentaires aux extrémités 3’ de chaque brin viennent s’hybrider
- Polymérisation: La Taq polymérase assure l,élongation du brin complémentaire
Quelles sont les différences entre une PCR traditionnelle et une PCR en temps réel?
- PCR: Quoi, qPCR: combien
- qPCR: utilisation de colorants fluorescents ou sondes
- PCR traditionnelle: électrophorèse nécessaire, qPCR: non
Quelles sont les deux techniques de fluorescence utilisées pour la qPCR?
SYBR green
Sondes Taqman
Quelle technique de fluorescence pour la qPCR est la plus simple?
SYBR Green, utilisation colorant qui a la propriété de devenir fluorescent lorsqu’il se lie à une molécule d’ADN double brin.
Expliquer le principe de la technique de fluorescence SYBR Green.
Colorant qui devient fluorescent lorsqu’il se lie à une molécule d’ADN double brin
À chaque cycle, de nouvelles molécules d’ADN double brin sont produites, ce qui émet un signal fluorescent proportionnel à la quantité d’ADN.
Quels sont les avantages et les désavantages d’utiliser la technique de fluorescence SYBR Green?
Avantages: Utilisation très simple et moins couteuse
Désavantages: Pas spécifique, toutes les molécules d’ADN dont les dimères d’amorces et les molécules d’ADN amplifiées de façon non spécifiques sont détectées
les amorces doivent être très spécifiques pour amplifier seulement le gène d’intérêt
Expliquer le mode de fonctionnement de la sonde Taqman.
La sonde Taqman s’hybride sur l’ADN cible.
Lorsque d’ADN polymérase l’atteint, son activité exonucléase clive le fluorophore et dégrade la sonde.
La molécule fluorescente est alors libérée de l’effet de l’extincteur et on peut mesurer un signal fluorescent correspondant à ce fluorophore.
Plus il y a d’amplification, plus il y a de signal fluorecent
De quoi sont composées les sondes Taqman?
- Séquence spécifique à une portion centrale du fragment d’ADN amplifié
- Fluorophore
- Extincteur
Quel est la fonction de l’extincteur (Sondes Taqman)?
Lorsqu’il se trouve à proximité du fluorophore, empêche ce dernier d’émettre un signal fluorescent.
Quelle technique de fluorescence pour la qPCR est la plus spécifique?
Pourquoi?
Sondes Taqman
La sonde Taqman s’hybride sur l’ADN cible et seulement les brins amplifiés sont fluorescents
Qu’est-ce que la valeur Cq?
(Cycle quantity)
permet d’identifier la position de la courbe, basée à l’endroit où celle-ci croisent la ligne horizontale de seuil.
Quelle est l’équation de la quantité selon la valeur Cq?
Qu’est-ce que la valeur Ct?
Position de la ligne horizontale de seuil selon une valeur qui représente le nombre de cycles.
la valeur de Ct est directement en relation avec la quantité initiale d’ADN.
Avec quoi Ct et Cq sont en relation?
Cq: la quantité d’ADN et Cq sont en relation
Ct: en relation avec la quantité initiale d’ADN
Quelle est la probabilité d’apparition du site GAATTC ?
GAATTC = 6 bases
probabilité: (1/4)^6
(4 car 4 bases diff/rentes possibles, ACTG)
les gels de polyacrylamide sont utilisés pour quels fragments d’ADN?
Pour les fragments de taille inférieure à 500 pb
Différencier le gel d’agarose du gel de polyacrylamide au niveau de leur composition.
Agarose: polysaccharide
Polyacralymide: polymère dont la chaîne s,allonge à mesure que la concentration croît.
Gel d’agarose:
On utilise un gel de ______ concentrations pour séparer de gros fragments.
Faibles
gels d’agarose:
Plus un fragment d’ADN est _______, plus sa migration est rapide et plus il migre loin dans le gel.
Petit
Électrophorèse:
À mesure qu’on augmente le voltage, les fragments les plus gros migrent proportionnellement …
Un peu plus rapidement que les petits.
Quel est le voltage maximum pour l’électrophorèse sur gel de fragments de 2kb et + ?
Maximum 5 volts/cm séparant les 2 électrodes
Quelle est le nom de la technique utilisée lors d’un transfert de Western, où on utilise des anticorps, qui sont complémentaires à des antigènes (protéines)?
Immunodétection
Quel est le nom de la première technique de séquençage, la plus simple.
Séquençage de Sanger (ddNTP)
Quelle doit être particularité du gène, si on veut utiliser une sonde dégénérée?
Le gène doit s’exprimer en protéine
En qPCR, que permet l,analyse de la courbe de fusion (Tm)?
Vérifier la nature du produit
