Chap 4 - Techniques et méthodes d'exploration anatomique Flashcards
Quels sont les deux grands types de méthodes d’exploration utilisées en neurosciences ?
Quelles sont les 2 catégories de techniques
que l’on distingue ? les définir
Méthodes
> anatomiques et structurelles
> fonctionnelles
Techniques
> in vitro (sur prélèvement, en dehors de l’organisme vivant, parfois après sacrifice ou mort naturelle)
> in vivo (sur organisme vivant)
Définir cytologie et histologie
Quel terme emploie-t-on pour regrouper les deux
dans le langage courant ?
Grâce à quelle évolution technique se sont elles développées ?
Cytologie
> étude morphologique de cellules isolées
Histologie
> étude structure et organisation des tissus biologiques
> employé comme terme générique couramment
Dév grâce à la microscopie
liée aux avancées en physique optique
puis électronique
(notamment distinction des différents types de cellules neuronales et gliales)
Citer 3 principes généraux
en microscopie optique
1/ Fixation
2/ Inclusion et coupes
3/ Coloration
Principe de fixation en microscopie optique
Pourquoi ?
Comment ?
> traiter pour éviter décomposition échantillon
(par putréfaction ou autolyse)
et l’étudier dans un état le plus proche possible du vivant
1/ cryofixation
> congélation ultra rapide par gaz liquide
pour transformer l’eau des échantillons
en glace vitreuse amorphe
> avantage : n’altère quasiment pas les molécules biologiques
2/ fixation chimique
> avec aldéhydes :
liquides fixateurs comme le formol
permet fixation + durcissement des tissus
> obtenue par perfusion du liquide
dans système cardiovasculaire de l’animal
ou par immersion de petits morceaux
Microscopie optique :
Après fixation que fait on des échantillons ?
Durcissement qui permettra coupes fines et régulières
> par congélation
> ou bien inclusion :
tissus enrobés de paraffine ou résine
Puis découpe avec appareils de précision
> microtome, cryotome
> coupes de 1 à 100 micromètres
ensuite disposées sur des plaques de verre ou lames
Peut-on observer directement des coupes d’échantillons au microscope ?
En général non car
les tissus biologiques présentent
très peu de contraste
> > à moins d’utiliser
un microscope à contraste de phase,
il faut les colorer
pour pouvoir discerner les constituants
Microscopie optique :
Principes de la coloration ?
But = augmenter le contraste de l’échantillon,
mettre en valeur certains éléments
Centaines de techniques
et multitude de colorants possibles
qui vont interagir +/- spécifiquement
avec les composants des cellules
Citer deux méthodes de coloration
utilisées pour les tissus nerveux
- coloration de Nissl
- coloration de Golgi
Coloration de Nissl
colorants bleus
la plus utilisée pour le tissu nerveux
Colorants se lient aux constituants
contenant des acides nucléiques (ADN, ARN)
» colorent spécifiquement les corps cellulaires
et permet donc
d’observer l’org° générale du tissu nerveux
et même de distinguer différents types de neurones
Coloration de Golgi
dite aussi “réaction noire”
par imprégnation au nitrate d’argent
très utilisée par neurobiologistes
Colore avec grande précision certains neurones
et leur prolongement
(environ 1% de l’échantillon)
> on ne sait pas expliquer cette sélectivité
> elle permet d’observer notamment
les interconnexions entre différentes couches corticales
Quel est le principe de l’histochimie classique ?
Application d’un réactif
dont on sait qu’il va réagir spécifiquement
avec certaines molécules de l’échantillon
> Contact réactif / molécules
> réaction chimique
> > Apparition de composés colorés ou fluorescents
= marquage spécifique
des cellules contenant ces molécules
ciblées par le réactif
Exp d’application de l’histochimie classique
Utilisation d’acide glyoxylique
pour cibler les monoamines
» production d’un composé fluorescent
= met en évidence par exp les catécholamines
Principe de l’autoradiographie
Permet localisation de molécules
marquées par des atomes radioactifs
On utilise bcp en pharmacologie
la technique du “binding” :
localiser des récepteurs ou sites de liaison
par l’intermédiaire des molécules marquées
qui vont s’y attacher (par exp des NT)
Expliquer les étapes de l’autoradiographie
pour localiser les sites récepteurs d’un NT
1/ Construction du ligand marqué (càd de sa forme radioactive NT*) en lui ajoutant un atome de tritium > dont la désintégration émet un électron que l'on pourra détecter
2/ Ajout du ligand marqué sur la coupe
» il va se lier aux récepteurs présents
puis rinçage pour éliminer les ligands excédentaires
3/ Coupe recouverte d’une pellicule ou émulsion sensible aux émissions radioactives du tritium
= impression des émissions
dans l’obscurité pendant plusieurs jours/mois
4/ Révélation (comme photo argentique)
> sites récepteurs = poins noirs
sur la couche photographique
(+ éventuellement coloration pour mieux distinguer structures nerveuses concernées)
Avantages de l’autoradiographie numérique ?
l’autoradiographie numérique par Béta-Imager
permet
> d’obtenir des images avec des concentrations radioactives
environ 10 fois inférieures
à celles nécessaires pour film photographique
> et donc de réduire le temps d’exposition nécessaire à la révélation d’un facteur 100 (on passe ainsi de plusieurs jours à quelques heures).
Principe de l’immunohistochimie
Permet de localiser des molécules spécifiques
sur des coupes
en faisant appel à des anticorps,
molécules de défense de l’organisme
qui ciblent des antigènes spécifiques
(molécules étrangères : virus, bactérie…)
Immunohistochimie :
Comment obtient-on l’anticorps
dirigé contre la molécule
que l’on souhaite localiser ?
On injecte la molécule que l’on souhaite localiser
(en la liant à une molécule plus grosse
si elle est trop petite pour que l’organisme réagisse)
dans le corps d’un animal vivant
> > Organisme produit un anticorps
dirigé contre cette molécule antigène
> > Extraction de l’anticorps, purification
et marquage avec radioélément ou molécule fluorescente
= excellent outil de localisation de l’antigène
Immunohistochimie directe
Anticorps marqué
est dilué et appliqué sur l’échantillon
Il va repérer et se lier à l’antigène s’il est présent
On va ensuite le localiser
en utilisant la méthode approprié
selon la technique de marquage
(autoradiographie, microscopie à fluorescence…)
Immunohistochimie indirecte
> But ?
Exemple ?
Mécanisme ?
But = amplifier les marquages
par des cascades de réactions anticorps-antigène
Exp : > On injecte une molécule X dans un lapin qui produit des anticorps anti-X > Ces anticorps de lapin anti-X sont injectés dans un mouton qui produit des anticorps anti-anti-X
Anticorps de lapin déposés sur la coupe à étudier >> se lient à leurs antigènes Puis anticorps de mouton, préalablement marqués, sont appliqués >> se lient aux anticorps de lapin et révèlent la localisation des antigènes X
Mécanisme d'amplification du au fait que les 2nds anticorps trouvent généralement plusieurs sites de liaison sur le premier anticorps
Immunohistochimie indirecte
On peut également procéder à ?..
Des double marquages ou marquages multiples
càd localiser 2 ou + antigènes
sur une même coupe
en utilisant par exp
des marquages de fluorochromes
de différentes couleurs
Quelle technique d’histochimie
utilise-t-on couramment
en complément des autres ?
pourquoi ?
L’hybridation in situ
en particulier lorsqu’on étudie
les protéines neuronales
>> pour s'assurer que la protéine a bien été fabriquée par le neurone dans lequel on l'a trouvée (et non capturée par endocytose) on va chercher si le matériel de synthèse propre à cette protéine est également présent dans le neurone
Hybridation in situ
Que cherche-t-on précisément ?
Comment ?
L’ARNm correspondant à la protéine
On va composer la synthèse de
la molécule d’ADN ou d’ARNm
complémentaire à celle-ci
nommée SONDE
Puis on applique la sonde préalablement marquée
sur la coupe étudiée
et on rassemble les conditions physico-chimiques
pour que puisse avoir lieu l’ASSEMBLAGE
avec l’ARNm recherché
Marqueur ensuite révélé avec la méthode appropriée
» dévoile localisation cellulaire de l’ARNm
Récap des techniques d’histochimie
- Histochimie classique
- Autoradiographie
- Immunohistochimie directe et indirecte
- Hybridation in situ
Limite des microscopes à fluorescence classique ?
Images de faible définition
car :
> lumière du microscope excite molécules
sur épaisseur trop importante de la coupe
émissions fluorescentes diffusent
dans tout le volume de la coupe
Avancée technologique récente
en microscopie optique ?
Microscopie confocale
à balayage laser
Bien meilleure résolution car :
> lasers focalisés sur un unique plan de la coupe
> associés à un diaphragme variable qui élimine les émissions fluo des autres plans
Qu’est ce que la transgénèse ?
Modif du génome d’un animal
pour qu’il produise lui même des molécules fluorescentes
On associe le gène d’une protéine cible
à la GFP (protéine fluo verte issue d’une méduse)
> > quand la cible sera synthétisée,
la GFP le sera aussi
et donc les protéines cibles seront
naturellement marquées et repérables
et pourront notamment
être prélevées et utilisées comme marqueurs
Type particulier de microscopie confocale ?
techniques de
microscopie confocale non destructives
» autorisent le suivi in vivo
de protéines marquées
En quoi les techniques de microscopie optique sont limitées par les propriétés physiques de la lumière ?
Quelle solution ?
elles autorisent un grossissement maximal de l’ordre de 1200 fois >> insuffisant pour les neurosciences (étude structure membranes neurones ou contacts synaptiques par exp)
Solution = microscope électronique
> grossissement de 20 000 à 100 000 fois
pour les plus courants
> utilisent des électrons
Expliquer principe de la TEM
microscopie élec de transmission
canon à électrons génère un faisceau
dirigé sur la coupe
les électrons sont +/- absorbés
par les organites cellulaires selon leur densité
les électrons non absorbés càd TRANSMIS
sont recueillis sur un capteur ou film photo
» on obtient une image des structures cellulaires
(ombre chinoise)
Traitements des échantillons pour analyse avec TEM
Fixation / inclusion / coupe
+
produits chimiques rendant
les structures cellulaires
plus opaques aux électrons
puis on peut utiliser toutes les méthodes d’histochimie décrites, à condition que les marqueurs soient très opaques aux électrons
Principe de la MEB
(microscopie élec à balayage)
dite aussi SEM (scanning electron microscopy)
Echantillon n’a pas besoin d’être coupé en tranches :
Fixation
puis on le couvre d’une couche métallique très fine
par pulvérisation (or le plus souvent)
Surface de l’échantillon est balayée
par faisceau d’électrons
Et électrons réémis par l’échantillon
sont recueillis par des détecteurs
> > image haute résolution
de la SURFACE de l’échantillon
Grâce à quoi peut on aussi analyser des échantillons frais, sans traitement, avec un MEB ?
Grâce à une enceinte à très haute pression
les nouvelles méthodes ne remplacent pas tant les méthodes traditionnelles qu’elles ne reposent sur leurs solides fondations.
> exemples de techniques récentes ?
Brainbow
> chaque neurone marqué d’une couleur spécifique
à l’aide de protéines fluorescentes
Clarity
> rendre cerveau transparent en remplaçant graisses par un gel spécifique»_space; structures parfaitement visibles
Microscopie expansive
> faire grossir l’échantillon en écartant les molécules
tout en préservant sa structure
Quel pb posent les techniques
de microscopie aujourd’hui ?
Pb du stockage de l’immense quantité de données générées par ces techniques
= 1,3 milliard de To pour un cerveau humain entier
alors que la capacité de stockage numérique mondiale représente “seulement” le double…
Récap techniques récentes de microscopie ?
- Micro confocale à balayage laser
- Micro élec de transmission TEM
- Micro élec à balayage MEB
Principe de la radiographie classique
Technique d’imagerie reposant sur l’utilisation des rayons X :
rayons sont plus ou moins déviés ou absorbés
selon la densité et l’épaisseur du corps traversé
et vont s’imprimer sur un film photo
ou être détectés électroniquement
pour produire une image dont les contrastes correspondent aux structures traversées
Utilité de la radiographie classique pour étudier le cerveau ?
Toutes les parties du cerveau ont +/-
la même densité aux rayons X
» ne donnent que très peu d’infos
sur la structure du tissu cérébral
Elle peut toutefois être utilisée
pour détecter la présence de corps étrangers
(e.g., balle de fusil) et ainsi comprendre
l’origine de troubles neurologiques divers.
Technique dérivée de la radiographie ?
Angiographie :
augmentation du contraste tissu/vaisseaux
par injection dans la circulation
de produits de contraste
(substances opaques aux rayons X, à base d’iode)
>> angiogrammes cérébraux permettent de discerner principaux vaisseaux sanguins du cerveau et détecter des anomalies vasculaires indiquant des pb circulatoires ou la présence de tumeurs cérébrales
Technique de radiographie assistée par ordinateur ?
Tomographie aux rayons X (scanner)
Faisceau étroit de rayons X
balaye le corps sous différents angles
et l’intensité des rayons transmis
est enregistrée par des capteurs très sensibles
> permet d’obtenir des images numériques 3D
des organes ou tissus
sous forme de coupes (tomos)
de qq mm d’épaisseur
Scanner du cerveau
> que faut-il souvent ?
A quoi faut il veiller concernant les rayons X ?
Injecter des produits de contraste dans la circulation
/!\
rayons X = radiations ionisantes
bien que non radioactives
» éviter l’exposition à des doses importantes
qui pourrait causer des brûlures, cancers,
anomalies chez nourrisson…
»> IRM aujourd’hui plus sûre
Quelle technique est devenue
la technique d’imagerie cérébrale par excellence ?
L’IRM et en particulier l’IRM fonctionnelle
Outil majeur de diag et suivi thérapeutique
de multiples pathologies, en particulier cérébrales,
à tous les âges de la vie
La notion de RMN renvoie à…
A l’origine de la quasi-totalité des applications médicales actuelles de la résonance magnétique, on trouve…
A la propriété magnétique des noyaux des atomes
Les noyaux des atomes d’hydrogène
> présent en très grande quantité dans les tissus bio
> riche en eau (H2O)
Qu’est ce qui provoque l’apparition
d’une aimantation nucléaire ?
Qu’appelle-t-on le spin ?
la rotation du noyau sur lui même
l’axe du noyau
devenu un petit aimant en rotation
En l’absence de champ magnétique particulier
(autre que le champ magnétique terrestre, très faible),
les spins des noyaux d’hydrogène d’un échantillon particulier (e.g., un corps humain, un cerveau) sont…
Si on place cet échantillon
dans un champ magnétique puissant (nom ?)…
orientés aléatoirement
B0»_space; les spins vont s’orienter
parallèlement à l’axe
de ce champ magnétique
Les spins sont ils parfaitement alignés sur l’axe B0 ?
Vitesse de rotation appelée ?
Non
les spins tournent autour de l’axe formé par B0
= mouvement de précession
Vitesse de précession
= fréquence de Larmor
Etape suivant l’application du champ B0 ?
Pourquoi parle-t-on d’impulsions de radiofréquence ?
Etape d’impulsion :
faire basculer l’aimantation nucléaire
créée par B0
au moyen d’une onde électromagnétique
dont la fréquence correspond
à la fréquence de Larmor des noyaux d’hydrogène
l’angle de basculement dépend
de l’intensité et la durée d’émission de l’onde
généralement très brèves en IRM
> on parle d’impulsions de radiofréquence
Etape après l’impulsion
Relaxation
= spins retournent à leur position d’équilibre
suivant l’axe B0
> mouvement de précession qui génère une onde électromagnétique
= signal de RMN ou précession libre
> qu’on pourra mesurer avec une antenne spéciale
A partir de quoi crée-t-on les images d’IRM ?
des paramètres de relaxation T1 et T2
issus du signal de RMN
Récap des étapes clés de la RMN
1/ Désordre
2/ Alignement sur B0
3/ Basculement
4/ Retour à l’alignement
> extraction de T1 et T2
Pour quelle raison peut on construire des images d’IRM précises du corps et surtout du cerveau ?
Parce que
les différents tissus nous composant
(LCR, sub grise, sub blanche, graisse…)
ont des paramètres de relaxation (T1 et T2) différents.
(= vitesse du retour à l’alignement diffère
selon nature du milieu où se trouvent les noyaux d’hydrogène)
De quoi se compose un imageur IRM ?
1/
1/ un tube contenant l’aimant principal supraconducteur
qui crée le champ B0
> couramment de 1,5 ou 3 Tesla mais il en existe des plus élevés
plus le champ principal est élevé,
> plus le signal émis lors du retour à l’équilibre
de l’aimantation sera fort
> et meilleure sera la qualité de l’image.
(imageur de 11,7T en cours d’installation au centre Neurospin de Saclay
> accès échelle mésoscopique càd 1/10e de mm pour étudier l’organisation des neurones)
De quoi se compose un imageur IRM ?
2/
2/ Bobines de gradient
qui permettent de faire varier
intensité du champ magnétique
de manière linéaire
> > champ B0 pas parfaitement homogène dans le tube
= important car ce sont ces différences
avant/arrière, haut/bas, droite/gauche
qui permettent d’exciter sélectivement le cerveau
« tranche par tranche »
et, en retour, de localiser d’où provient le signal de RMN.
> > réalisation de coupes axiales, sagittales et coronales
+ diverses coupes obliques
De quoi se compose un imageur IRM ?
3/
3/ Des antennes d’émissions / réception de radiofréquences
+ antenne au plus près tête patient pour imager cerveau
De quoi se compose un imageur IRM ?
4/
4/ équipement informatique
pour paramétrer acquisition
et reconstruire les images
Paramètres d’acquisition d’une image IRM ?
- Coupes : orientation, nombre et épaisseur
- Volume d’acq° : cerveau entier ou une partie
- Temps de répétition TR (temps entre 2 impulsions)
- Temps d’échos TE (temps entre impulsion et acq° signal)
> choix complexes car paramètres interdépendants
Comment le signal RMN est-il transformé en image ?
pour chaque coupe
on transforme le signal de résonance (T1 ou T2)
de chaque voxel (petit volume du cerveau - 3D)
en un pixel (2D) en échelle de gris
tissus au signal intense = couleur claire
> hypersignal
tissus au signal faible = couleur sombre
> hyposignal
CONTRASTE
influencé par T1 ou T2
selon les paramètres d’acquisition
air et os = toujours noir car pas d’hydrogène
En résumé
intérêt de l’IRM
risques ?
- obtenir en qq minutes
des images d’un cerveau complet
avec une déf de l’ordre du mm cube - qui peuvent être traitées numériquement
pour composer une représentation en 3D - technique parfaitement inoffensive,
aucun rayonnement ionisant,
aucun effet secondaire connu - seule contre-indication étant la présence d’objets métalliques dans le corps
IRM de diffusion
permet de visualiser ?
pour ?
fibres de la substance blanche
pour appréhender in vivo > la complexité de l'architecture axonale, > son organisation dans l'espace, > ou ses changements de structure induits par une pathologie
IRM de diffusion
images construites sur la base de ?
de mesures des mouvements
des molécules d’eau dans le cerveau
> diffusion dite anisotropique :
déplacement plus rapide
le long des faisceaux de fibres parallèles
> on mesure dans chaque voxel acquis
la direction dans laquelle
la diffusion des molécules d’eau est la plus rapide
pour obtenir direction des fibres point par point
technique d’imagerie
utilisant l’IRM de diffusion ?
tractographie par tenseur de diffusion
> points reliés avec logiciels de post-traitement
pour composer images couleurs
/!\ on obtient les connexions entre les aires du cerveau
mais pas le sens de celles-ci
Récap des techniques d’imagerie in vivo
- radiographie classique
- angiographie
- tomographie aux rayons X
- IRM anatomique
- IRM de diffusion
