Chap 4 - Techniques et méthodes d'exploration anatomique Flashcards
Quels sont les deux grands types de méthodes d’exploration utilisées en neurosciences ?
Quelles sont les 2 catégories de techniques
que l’on distingue ? les définir
Méthodes
> anatomiques et structurelles
> fonctionnelles
Techniques
> in vitro (sur prélèvement, en dehors de l’organisme vivant, parfois après sacrifice ou mort naturelle)
> in vivo (sur organisme vivant)
Définir cytologie et histologie
Quel terme emploie-t-on pour regrouper les deux
dans le langage courant ?
Grâce à quelle évolution technique se sont elles développées ?
Cytologie
> étude morphologique de cellules isolées
Histologie
> étude structure et organisation des tissus biologiques
> employé comme terme générique couramment
Dév grâce à la microscopie
liée aux avancées en physique optique
puis électronique
(notamment distinction des différents types de cellules neuronales et gliales)
Citer 3 principes généraux
en microscopie optique
1/ Fixation
2/ Inclusion et coupes
3/ Coloration
Principe de fixation en microscopie optique
Pourquoi ?
Comment ?
> traiter pour éviter décomposition échantillon
(par putréfaction ou autolyse)
et l’étudier dans un état le plus proche possible du vivant
1/ cryofixation
> congélation ultra rapide par gaz liquide
pour transformer l’eau des échantillons
en glace vitreuse amorphe
> avantage : n’altère quasiment pas les molécules biologiques
2/ fixation chimique
> avec aldéhydes :
liquides fixateurs comme le formol
permet fixation + durcissement des tissus
> obtenue par perfusion du liquide
dans système cardiovasculaire de l’animal
ou par immersion de petits morceaux
Microscopie optique :
Après fixation que fait on des échantillons ?
Durcissement qui permettra coupes fines et régulières
> par congélation
> ou bien inclusion :
tissus enrobés de paraffine ou résine
Puis découpe avec appareils de précision
> microtome, cryotome
> coupes de 1 à 100 micromètres
ensuite disposées sur des plaques de verre ou lames
Peut-on observer directement des coupes d’échantillons au microscope ?
En général non car
les tissus biologiques présentent
très peu de contraste
> > à moins d’utiliser
un microscope à contraste de phase,
il faut les colorer
pour pouvoir discerner les constituants
Microscopie optique :
Principes de la coloration ?
But = augmenter le contraste de l’échantillon,
mettre en valeur certains éléments
Centaines de techniques
et multitude de colorants possibles
qui vont interagir +/- spécifiquement
avec les composants des cellules
Citer deux méthodes de coloration
utilisées pour les tissus nerveux
- coloration de Nissl
- coloration de Golgi
Coloration de Nissl
colorants bleus
la plus utilisée pour le tissu nerveux
Colorants se lient aux constituants
contenant des acides nucléiques (ADN, ARN)
» colorent spécifiquement les corps cellulaires
et permet donc
d’observer l’org° générale du tissu nerveux
et même de distinguer différents types de neurones
Coloration de Golgi
dite aussi “réaction noire”
par imprégnation au nitrate d’argent
très utilisée par neurobiologistes
Colore avec grande précision certains neurones
et leur prolongement
(environ 1% de l’échantillon)
> on ne sait pas expliquer cette sélectivité
> elle permet d’observer notamment
les interconnexions entre différentes couches corticales
Quel est le principe de l’histochimie classique ?
Application d’un réactif
dont on sait qu’il va réagir spécifiquement
avec certaines molécules de l’échantillon
> Contact réactif / molécules
> réaction chimique
> > Apparition de composés colorés ou fluorescents
= marquage spécifique
des cellules contenant ces molécules
ciblées par le réactif
Exp d’application de l’histochimie classique
Utilisation d’acide glyoxylique
pour cibler les monoamines
» production d’un composé fluorescent
= met en évidence par exp les catécholamines
Principe de l’autoradiographie
Permet localisation de molécules
marquées par des atomes radioactifs
On utilise bcp en pharmacologie
la technique du “binding” :
localiser des récepteurs ou sites de liaison
par l’intermédiaire des molécules marquées
qui vont s’y attacher (par exp des NT)
Expliquer les étapes de l’autoradiographie
pour localiser les sites récepteurs d’un NT
1/ Construction du ligand marqué (càd de sa forme radioactive NT*) en lui ajoutant un atome de tritium > dont la désintégration émet un électron que l'on pourra détecter
2/ Ajout du ligand marqué sur la coupe
» il va se lier aux récepteurs présents
puis rinçage pour éliminer les ligands excédentaires
3/ Coupe recouverte d’une pellicule ou émulsion sensible aux émissions radioactives du tritium
= impression des émissions
dans l’obscurité pendant plusieurs jours/mois
4/ Révélation (comme photo argentique)
> sites récepteurs = poins noirs
sur la couche photographique
(+ éventuellement coloration pour mieux distinguer structures nerveuses concernées)
Avantages de l’autoradiographie numérique ?
l’autoradiographie numérique par Béta-Imager
permet
> d’obtenir des images avec des concentrations radioactives
environ 10 fois inférieures
à celles nécessaires pour film photographique
> et donc de réduire le temps d’exposition nécessaire à la révélation d’un facteur 100 (on passe ainsi de plusieurs jours à quelques heures).
Principe de l’immunohistochimie
Permet de localiser des molécules spécifiques
sur des coupes
en faisant appel à des anticorps,
molécules de défense de l’organisme
qui ciblent des antigènes spécifiques
(molécules étrangères : virus, bactérie…)
Immunohistochimie :
Comment obtient-on l’anticorps
dirigé contre la molécule
que l’on souhaite localiser ?
On injecte la molécule que l’on souhaite localiser
(en la liant à une molécule plus grosse
si elle est trop petite pour que l’organisme réagisse)
dans le corps d’un animal vivant
> > Organisme produit un anticorps
dirigé contre cette molécule antigène
> > Extraction de l’anticorps, purification
et marquage avec radioélément ou molécule fluorescente
= excellent outil de localisation de l’antigène
Immunohistochimie directe
Anticorps marqué
est dilué et appliqué sur l’échantillon
Il va repérer et se lier à l’antigène s’il est présent
On va ensuite le localiser
en utilisant la méthode approprié
selon la technique de marquage
(autoradiographie, microscopie à fluorescence…)
Immunohistochimie indirecte
> But ?
Exemple ?
Mécanisme ?
But = amplifier les marquages
par des cascades de réactions anticorps-antigène
Exp : > On injecte une molécule X dans un lapin qui produit des anticorps anti-X > Ces anticorps de lapin anti-X sont injectés dans un mouton qui produit des anticorps anti-anti-X
Anticorps de lapin déposés sur la coupe à étudier >> se lient à leurs antigènes Puis anticorps de mouton, préalablement marqués, sont appliqués >> se lient aux anticorps de lapin et révèlent la localisation des antigènes X
Mécanisme d'amplification du au fait que les 2nds anticorps trouvent généralement plusieurs sites de liaison sur le premier anticorps
Immunohistochimie indirecte
On peut également procéder à ?..
Des double marquages ou marquages multiples
càd localiser 2 ou + antigènes
sur une même coupe
en utilisant par exp
des marquages de fluorochromes
de différentes couleurs
Quelle technique d’histochimie
utilise-t-on couramment
en complément des autres ?
pourquoi ?
L’hybridation in situ
en particulier lorsqu’on étudie
les protéines neuronales
>> pour s'assurer que la protéine a bien été fabriquée par le neurone dans lequel on l'a trouvée (et non capturée par endocytose) on va chercher si le matériel de synthèse propre à cette protéine est également présent dans le neurone
Hybridation in situ
Que cherche-t-on précisément ?
Comment ?
L’ARNm correspondant à la protéine
On va composer la synthèse de
la molécule d’ADN ou d’ARNm
complémentaire à celle-ci
nommée SONDE
Puis on applique la sonde préalablement marquée
sur la coupe étudiée
et on rassemble les conditions physico-chimiques
pour que puisse avoir lieu l’ASSEMBLAGE
avec l’ARNm recherché
Marqueur ensuite révélé avec la méthode appropriée
» dévoile localisation cellulaire de l’ARNm
Récap des techniques d’histochimie
- Histochimie classique
- Autoradiographie
- Immunohistochimie directe et indirecte
- Hybridation in situ
Limite des microscopes à fluorescence classique ?
Images de faible définition
car :
> lumière du microscope excite molécules
sur épaisseur trop importante de la coupe
émissions fluorescentes diffusent
dans tout le volume de la coupe
