Chap 2 Techniques D'analyse De La Composition Biochimique Des Cellules

Question 1

Quels sont les 3 types de chromatographies pour séparer les molécules

Answer 1

1.gel filtration
Les grosses protéines sortent en premier car les petites ont se la difficulté à se faufiler et restent collé aux billes de gel
2.antigène-anticorps
Les premières sont les protéines qui ne sont pas reconnues par les anticorps et les derniers sont celles visés
3.échange ionique
Ex. Si on veut récupérer les protéines chargés négativement, les positives sortent en premier et met nacl (compétition) pour faire décoller les négatives

Question 2

Quelles sont les 8 techniques d’analyse acide nucléique et protéines

Answer 2

1. immuno-histochomie (ihc)
2. immunofluorescence (ifc)
3. FACS (cryométrie de flux)
4. ELISA
5. hybridation in situ
6. Southern-blot
7. Western blot
8. nothern-blot

Question 3

Deçrire le principe et les étapes pour la détection d’une protéine d’intérêt à l’aide d’anticorps sur support SOLIDE

Answer 3

Principe (a partir d’un homogenat cellulaire)

1. séparation des protéines selon leur poids moléculaire (électrophorèse-dans un champ électrique)
2. immunodetection de la protéine d’intérêt-avec anticorps

ÉTAPES

1. extraction et préparation des protéines des échantillons biologiques
2. migration (par electrophorese dans un support avec gel/pas malléable) et transfert sur une membrane
3. immunodetection

Question 4

Expliquer le principe de la centrifugation

Answer 4

1.rupture des cellules pour libérer organites et autres constituants broyage de cellule. On les met d’abord dans une solution de pH salin saccharose isotonique (avec mixeur, Potter, ultrason, choc osmotique…) pour obtenir un homogenat cellulaire (organites en suspension + débris cellulaire +constituants biochimiques en solution
2.séparation des constituants par centrifugation;
particules les plus massifs sont au fond
Plus la vitesse de centrifugation est rapide, plus on sépare les molécules en petites tailles

Question 5

Expliquer le principe de l’ultracentrifugation différentielle

Answer 5

Basé sur la difference de vitesse de sédimentation des organites
Permet de separer des organites avec faible difference de taille
Milieu froid
Centrifugations successives de plus en plus rapide

Question 6

Expliquer le principe de l’ultracentrifugation sur gradient de densité

Answer 6

-permet de séparer en une seule fois des organites
-gradient de saccharose/sucrose pour les organites et protéine
-gradient de chlorure de césium pour les molécules d’acides nucléiques
Plus dense au fond

Question 7

Décrire les étapes pour le western blot (1a
3) détection des protéines totale (donc présence ou non) et immunobavardage (1-2 et 4 a 7) permet de déterminer spécifiquement une protéine

Answer 7

1. extraction des protéines cellulaires en condition dénaturante ( les protéines sont linéaires , pas de pont disulfure, chargées négativement)
2. Electrophorese sur gel d’acrylamide ( séparation seulement en fonction de la masse moléculaire des protéines car comme elles sont toutes chargés négativement, elles se dirigent vers le pole positif (anode)
3. Étape pour savoir s’il y a presence ou non de protéine : coloration des gels au bleu de coomassie
   Les protéines de même taille apparaissent sous la forme d’une bande
4. pré-hybridation des membranes (saturation de la membrane avec des protéines de lait)
5. Incubation avec l’anticorps primaire (anti corps qui cible la protéine) anti x
6. incubation avec l’anticorps secondaire (anticorps anti anti x)
7. révélation par chemiluminescence

Question 8

La techique de western blot permet de detercter quoi (2)

Answer 8

La présence ou non d’un proteine (sauvage ou muté)

La présence d’une protéine mutée plus courte ou plus grande

La technique est donc semi quantitative

Question 9

Expliquer le concept d’anticorps 1 et 2

Answer 9

Exemple: j’ai une protéine cible x humaine sur une membrane
Anticorps primaire de lapin anti x (la protéine x a été injecté dans un lapin et il a développé des anticorps de type igG anti x

Anticorps secondaire de chèvre anti anti x de lapin couple à une enzyme (les anti x de lapin ont été injecté à une chèvre et la chèvre a fait des anticorps anti lapin anti humain

Question 10

Être capable d’analyser une western blot
Qu’est-ce qu’une protéine contrôle
But? Savoir si protéine 1 et 2 sont présentes
Sert à quoi le contrôle interne?

Answer 10

Protéine contrôle: protéine qui est exprime de la même manière dans les échantillons contenant le protéine 1 et la protéine 2 (tubuline, actine, GADPH..)

Dans la protéine controle, toutes les échantillons devraient contenir le même nombre de protéine, donc les lignes devraient toutes avoir le même ton de noir (+ noir= + protéine)

Sert à quoi le contrôle interne?
1- la présence ou non d’une protéine ( sauvage ou mutée/plus courte)
2-si il y a plus d’une protéine en particulier, est ce que c’est parce ce qu’il y en a vraiment plus ou c’est parce qu’on a mis plus de protéines initialement dans l’échantillon

Question 11

Quel est le principe d’une gamme étalon

Answer 11

C’est une solution de référence avec différents dosage , donc selon la concentration voulu de la protéine contrôle, on mettra plus ou moins de volume pour pouvoir ensuite comparer l’es concentrations inconnus

Question 12

Décrire le dosage biologique Elisa

Answer 12

But: détecter la présence et la quantité d’une protéine
Étapes:
Enzyme peroxdase
1.On fait une gamme étalon avec protéine de référence BSA
2.Analyse par spectrométrie (plus foncé= plus protéine= plus de densité optique )

+rapide
- ne sait pas si protéine est active
-doit faire étalon
Sur support liquide

technique permettant la détection d’une protéine d’intérêt à l’aide d’anticorps sur support liquide (dosage)

Question 13

Décrire immunohistochimie (ihc) et immunofluorescence (ifc)

Answer 13

But: détecter la localisation d’une protéine spécifique à l’aide d’un ac marqué sur support solide (coupe tissu, culture tissulaire)
Ihc: traceur visible (colorant réaction enzymatique)
Ifc: traceur fluorescent (fluorochrome) DAPI bleu et GFP vert et RHODAMINE rouge

DOIT AMPLIFIER LE SIGNAL

Question 14

Décrire cytometrie de flux FACS

Answer 14

But:technique qui permet la mesure simultanée de plusieurs caractéristiques physique (trier les cellules selon la taille, forme, marquage ) de
CELLULES EN SUSPENSION
étapes:
Histogramme biparametrique ++ ou monoparametrique +

Tri de cellules exemple lymphocytes b de t

Négatif:lent et faible quantité de cellule qu’on peut étudier

Question 15

Décrire l’electrophorese bidirectionnel 2D

Answer 15

On réalise l’electrophorese dans un tube étroit de gel polyacrylamide ou un gradient de pH est établi et on soumet à un fort courant électrique, les protéines migrent vers leur phi

Ensuite on sépare selon la taille des protéines (sds page)

Positif: grande quantité étudié

Tri de cellules exemple lymphocytes b de t

Question 16

Expliquer le principe des essais enzymatiques

Answer 16

Permet de savoir si une protéine est fonctionnelle ou non
(U) unité d’activité enzymatique est définit en terme de quantité de substrat qui disparaît ou quantité de produit qui apparaît par unité de temps
(Mmol/min)

Question 17

Décrire les deux types de dosage pour les essais enzymatique

Il faut doser car valeurs trop hautes ou trop basses c’est pas bon

Answer 17

1.Dosage continu= dosage cinétique (C)
Mesure substrat ou produit tout le long de la réaction.
A.direct (oxyde nitrique NO provient de l’oxydation de l’arginine) vasodilatateur. Intérêt: pour voir l’activité on met hémoglobine
B.indirecte (créatine kinase CK) production énergie muscles. Intérêt du dosage:
2.Dosage discontinu (D)
Mesure substrat ou produit après un temps donné de la réaction.
A.phosphatase alcaline. Enzyme présente dans l’intestin, rate,reins..C’est une molécule en cycle donc elle est facilement reconnaissable par spectrométries)

Question 18

Quel est le dosage par fluorimetrie de la protease astacus

Answer 18

C’est une endopeptidase qui coupe la liaison peptidiques entre les résidus d’Arginine et alanine. La liaison cache la fluorescence possible du triptophane donc lorsqu’on coupe on peut la voir.