Chap 2 Technique D'etude En Biocell Flashcards
Caractéristique du microscope optique
Faisceau lumineux Limité par la diffraction Échantillon coloré mais vivant Possède 2 lentilles: 1.l’objectif = pour agrandir l’objet 2.l’oculaire= pour que les rayons arrivent à l’œil de manière parallèle
Possède un diaphragme= régler la quantité de lumière
0,2 micromètre (limité par la diffraction de la lumière)
Caractéristiques du microscope à contraste de phase (microscope optique)
- échantillon pas colore
- cellules isolées ou fines couches cellulaires
- Transforme les indices de réfraction de la lumière en différents niveaux de contraste
- Possède deux anneaux de phase: pour filtrer les rayons déphasés
La lumière se déplace plus lentement dans un milieu avec un indice élevé
DIC: permet de voir les détails, définit bien les contours, objets plus épais
Semble projeter une ombre
Caractéristiques du microscope à fluorescence (photonique-champ large)
Possède 2 sources de lumière:
- Halogène =pour les échantillons à transmission (classique)
- lampe à arc= le filtre d’excitation sélectionne les radiations spécifiques du fluorochrome qui sont réfléchis par le miroir dichroide et éclairent l’échantillon. Celui ci émet les radiations de fluorescence qui seules passe au travers du filtre d’émission et atteignent l’oculaire
*épifluorescence= plusieurs filtres
Fluorochrome: possède 2 spectres, absorption (lumière incidente) et émission (fluorescence)
*substance chimique est fluorescente si elle absorbe la lumière à une longueur d’onde plus petite que la longueur d’onde de la lumière émise
TRITC ROUGE
FITC VERT
DAPI BLEU se fixe sur adn
Les capteurs sont en noir et blanc donc il faut colorer les images par ordinateur.
Décrire le microscope confocal
Objectif = améliorer la résolution de l’image en observant la fluorescence uniquement dans un plan focal de l’échantillon.
nos cellules sont sphérique, en 3d
Pinhole = (diaphragme qui ne laisse passer qu’un point lumineux ) permet d’éliminer tous les signaux fluorescents situés en dehors du plan focal
Laser= (source lumineuse monochromatique) permet d’exciter les fluochromes donc pas de lampe
Photodetecteur: amplifie et transforme les photons en signal électrique qui sera numérisé en un niveau de gris
Pourquoi la microscopie électronique
Permet de voir les organites les plus petits et même certaines molécules (plus petit que 200nm)
*échantillons ne peuvent pas être vivant, demande une préparation, coupe très fine
Fonctionnement microscope électronique
Utilise un faisceau d’électrons plutôt que la lumière
0,4 a 20 nm
2 types:
1.met = (a transmission) seuls les électrons traversant la préparation sont analysés
2.meb =(a balayage) les électrons secondaires et rétro diffusés sont détectés
Besoin d’échantillons très mince afin d’être le plus possible transparent aux électrons
Pour meilleur contraste: métaux lourds pour mieux absorber et disperser les électrons. MAXIMISER les collisions avec les électrons
3 types d’électrons à la sortie de l’échantillon d’un microscope électronique
- Electrons transmis n’ayant pas interagi avec l’échantillon
- les électrons diffusés elastiquement (sans perte d’énergie) résultant de l’interaction des électrons incidents avec les atomes de l’échantillon
- les électrons diffuse inélastiquement (avec perte d’énergie)provenant de l’interaction des électrons incidents avec les cortèges électronique des atomes de l’échantillon
Pourquoi le meb fournit des images en noir et blanc
Principe: l’échantillon est balayé par un faisceau électronique et on vient détecter les électrons secondaires de très faibles energie qui sont produits suit au bombardement
Ces derniers sont sont amplifiés et interprété en produisant une image en fonction de l’intensité du courant électrique produit.
Donc différentes nuance de gris= intensité du courant détectée
2 contrainte pour la microscopie à lumière
- Épaisseur: les rayons lumineux doivent pourvoir traverser l’objet pour former image/ éviter les superpositions
Max 2 a 5 um
Méthode de là microtomie : confection de coupes - Contrastes: ex photonique ou à transmission:
Montage optique: utilise nature ondulatoire de la lumière (microscope à contraste de phase)
Colorations
Pourquoi il faut faire étape de fixation avant l’inclusion
Altération de l’organisation cellulaire
4 étapes de préparation pour la microscopie à lumière
1. Fixation = consolider Traitement chimique (formaldéhyde) Traitement thermique (azote liquide-limite la formation de cristaux) 2.inclusion= durcir Remplace l’eau par de la paraffine avec étapes de déshydratation successive à éthanol et toluène Pas toujours nécessaire si congélation 3.microtomie= couper 5 a 10 um Sur paraffine= 2 a 5 um 4.coloration= contraster
Décrire le colorant utilise comme méthode de préparation
Définition: molécule qui a la propriété d’absorber certaines longueurs d’onde de la lumière et de conférer une couleur au composant qui l’a lié
Groupement chromophore: absorbe certaines longueurs d’onde et confère la couleur
Groupement auxochrome: permet la liaison a certains constituants cellulaires
2 techniques permettant de colorer les composants cellulaires
A l’aide d’anticorps: techniques immunohistochimiques
A l’aide de sondes d’acides nucléiques: hybridation in situ ou fish
(cytogénétique): permet de visualiser la chromatine grâce à leur affinité pour l’adn et où les protéines qui lui sont associés
Exemple: *giemsa (rose)=colorant de base de toutes les techniques de marquage en bandes des chromosomes
*la moutarde de quinacrine
*le dapi bleu noyau
*l’iodure de propidium
Définition hybridation in situ
Appariement d’une séquence marquée connue d’acides nucléiques simple brin (sonde) à une ou plusieurs séquences complémentaires sur une préparation chromosomique ou des cellules fixées
Principe de l’hybridation in situ
Une sonde moléculaire est mise en contact avec les chromosomes d’une mitose et vas d’hybrider (se fixer) spécifiquement au niveau de la séquence complémentaire
On peut alors visualiser la sonde au microscope, ce qui identifie la région chromosomique dont elle est complémentaire
