C7. Techniques de biologie moléculaire Flashcards
Qu’est que l’ADN recombinant?
ADN obtenu in vitro par combinaison de 2 molécules d’ADN
Qu’est- ce qu’un insert ?
C’est un transgène, un fragment d’ADN comportant un séquences d’intérêt
Qu’est ce que la transfection?
Introduction d’acides nucléiques dans des cellules eucaryotes, cela permet de réprimer ou surexprimer un gène. Peut être transitoire ou stable avec une intégration dans l’ADN chromosomique.
Qu’est-ce que la transduction?
Introduction de matériel génétique dans une cellule
Que font les ligases?
Forme un lien phosphodiester entre le phosphate 5’ et le OH 3’ de 2 fragments d’ADN
Quelle est l’utilité des plasmide en biomol?
Utilisation en tant que vecteurs pour le clonage de séquence d’ADN d’intérêt en vue de les caractériser
Quel est le premier rôle des enzymes de restriction?
Issues des bactéries, elle coupe l’ADN étranger des virus (bactériophage) pour assurer la survie de la bactérie
Qu’est ce que la transformation?
introduction d’acides nucléiques dans des bactéries –> modification du génotype pour une plus grande stabilité des ADN et ARNs transférés
En quoi consiste la méthode de séquençage par dégradation chimique?
1) Marquage radioactif des extrémités des brins d’ADN
2) Modification chimique spécifique de l’ADN (4 types de réactions)
3) Clivage au niveau des liaisons phosphate des bases adjacentes aux bases ayant été modifiées
4) Migration des fragment d’ADN clivé sur gel d’acrylamide.
Explication de la méthode Sanger
Amplification d’ADN en présence de nucléotides modifiés radioactifs qui vont empêcher l’élongation
Utilisation de nucléotides didésoxyribonucléiques pour ne pas faire de liaison phosphate en position 3’ du ribose
Les fragments récupérés sont séparés par électrophorèse
Quelles sont les étapes de la méthode de Sanger
1) Dénaturation
2) Hybridation des amorces
3) Réaction de polymérisation
Quelles sont les 2 principales innovations de la méthode de Sanger
Marquage avec radioactivité est devenu marquage avec fluorescence (détection de signal)
Les fragments sont séparés par électrophorèse capillaire (séparation par taille)
–> automatisation de la méthode
Quels sont les points positif du séquençage à haut débit ?
Million de séquençage parallèle et détection des nucléotides incorporés directement après chaque cycle d’incorporation –> plus de passage par l’électrophorèse
- moins cher et plus rapide !
Quels sont les problèmes rencontrer dans le NGS?
- énorme quantité de données et complexe
- données brutes à interprétées
- problème étique lié au caractère personnel des données
Comment quantifier les acides nucléiques?
- quantification directe: mesure de l’absorbance de l’échantillon entre 260 et 280 nm (si le rapport des 2 mesures>1,8, contamination par protéines qui absorbent à 280 nm)
- quantification indirecte: mesure de la fluorescence émise par un agent intercalant (méthode + sensible et spécifique)
