Bioassays Flashcards
Einleitung
bezeichnet Experimente, mit denen man die Bioaktivität von Verbindungen quantifizieren und
detektieren kann
Problematik:
Anzahl und Tonnagen von Stoffen steigen weltweit rasant. (über 275 Millionen
Chemikalien & Gemische registriert)
- Zunahme der Chemikalienbelastung in der Umwelt
o Anstieg der Diversität und des Volumens an Substanzen
o Belastungen mit bekannte und „emerging contaminants“ („neue“ gestaltete
Substanzen: bioakkumulierende → mobile Stoffe; Langkettige PFAS ersetzt durch
kurzkettige PFAS)
o chronische Belastung mit niedrigen Konzentrationen mit vielen Substanzen
o Nicht alle Stoffe messbar - Mischungstoxizität / Kombinationswirkungen
o unter Nachweisgrenze möglich
o Die Mischung „wirkt“ (Mischungstoxizität) - Regulatorik
o Einzelstoffbewertung: REACH, WRRL
o Vielzahl an Spurenstoffen gibt es keine Grenzwerte
o keine Risikobewertung für Mischungen - Limitierungen der Reinigung (Kläranlagen)
Exposition:
gegenüber einer Vielzahl an Substanzen durch einen oder mehrere Expositionswege
Wozu Wirkungen quantifiziert?
Es ist unmöglich alle Stoffe in der Umwelt zu erfassen und zu quantifizieren, „reale“ (Summen-)
Wirkungen messen, Vorteil mit Bioassays kann man Effekte auf unterschiedlichem Niveau messen
Überblick: welche Wirkungen? Werktests
- Bioassay in-vitro und in-vivo: quantifizieren die Toxizität von Umweltproben unter definierten
Laborbedingungen (auf zellulärem oder individuellem Level) - Effekt Biomarker: zeigen die biologischen Reaktionen auf individueller oder niedrigerer
Organisationsebene bei Organismen an. - Ökologische Indikatoren: weisen die Effekte auf der Ebene von höheren biologischen
Organisationsebenen nach.
Überblick - welche Schadwirkungen
- zytotoxische Wirkungen: schädigende Wirkung auf die Zelle
- gentoxische Wirkungen: schädigende Veränderungen des Erbguts - DNA
- endokrine Wirkungen: schädigende Wirkungen auf das Hormonsystems
- krebserzeugende Wirkungen: Krebsauslösung (verringerte Lebensdauer, …)
- neurotoxische Wirkungen: schädliche Wirkungen auf das Nervensystem
Vorraussetzung für die Verdwendung - Bioassays, in vitro
- relevant: Verbindung zw. molekularem Ereignis u. einem schädigenden Effekt
- Standardisierung: der analytischen Methode nach ISO / CEN / DIN / OECD, damit sind Ergebnisse
von unterschiedlichen Labors vergleichbar und Aussagekraft ist bestätigt / anerkannt - Ergebnisse müssen bewertbar sein, Verfügbarkeit von in-vitro Ergebnissen und relativen
Wirkpotenzen
Bioassasy in vitro, CALUS
- kommerzielles System
- Chemically Activated Luciferase eXpression
- in-vitro Reportergen Bioassay (Luciferase)
- Human- oder Säugertierzelllinie
- Vielzahl an möglichen Wirkungen können quantifiziert werden (DNA-Schäden, DNA-
Reparatur, oxidativer Stress (Nrf2-CALUX), …)
Bioassays, CALUX Systeme - Testprinzip
- Rezeptor bindet an natürliche oder exogene synthetische Substanz
- Aktivierung eines Reportergens (Enzym = Luciferase)
- Luciferase setzt Substrat Luciferin um → leuchtet (Lichtintensität ~ Menge an Rezeptor
gebundenem Substrat) - Testdauer 3 Tage (Expositionszeit 24 h)
- Geeignet für: Umweltproben, Einzelstoffe, …
… in-vitro, CALUX® Systeme – Auswertung:
Standardkurve messen und auswerten, Umweltproben messen, Summenwirkung aus „Östrogen“
Agonisten und Antagonisten (mit unterschiedlich potenter Wirkung), Berechnung der
Äquivalenzwerte anhand der Standardwerte, Ergebnisse in Form von 17β-Östradiol Äquivalenten (z.B.
in Kläranlagenzulauf 0,14 μg/L EEQ)
Bioassays, in-vitro, cytotox-CALUX®:
Zelltod: humane Zelllinie (U2OS)
- konstitutive Expression der Luciferase
- Abnahme der Lucifierase Aktivität → Zytotoxizität
- Kontrolle für alle Bioassays, welche U2SO2 Zelllinie
verwenden& gentoxische Assays
Bioassays, in vitro, AMES test
- Probe darf nicht zytotoxisch ein
- erstes Screening auf gentoxisches Aktivität
- je mehr his + Revertanten, desto mehr “mutagener” die Probe
- Probe ist mutagen oder nicht mutagen?
- Testsystem umfasst negativ und positive Kontrollen
Endpunkte: Anzahl der Reveranten pro Platte - Spontane Mutation in neg. Kontrolle = Hintergrund
Bioassays, in-vitro, umuC-Test (Aktivierung der DNA-Reparatur)
Testorganismus: Wirkung / Effekt: Aktivierung des SOS-Reparatursystems der Zelle (Basenaustausch, frameshift,
Deletionen, …)
Testprinzip: gentechnisch verändertes Bakterium, eine gentoxische Substanz induziert umuC-Gen, an
diesem ist ein Reportergen LacZ = Enzym gekoppelt. Enzym (β-Galactosidase) kann Farbstoff
umsetzen.
Relevanz: Nachweis von DNA-Schädigung (mit / ohne Leberextrakt)
Testdauer: 1.5 Tage (Expositionszeit: 2 Stunden)
Bioassays, in-vitro, COMET-Assay
- Gentoxizitätstest – Nachweis von DNA-Schäden
- Indikatortest – erfasst werden Effekte, die häufig parallel zu Mutationen induziert werden
- DNA-Läsionen müssen nicht zwingend zu Mutationen führen, da auch Reparatur möglich ist
- Zellen werden exponiert und dann in Gel (Agarose) eingebettet, DNA der Zellen wandert in einem
elektrischen Feld im Gel zur Kathode - Nachweis mittels Gelelektrophorese und Farbstoff
- Intakte DNA „Kopf“ (engl. head), fragmentierte DNA „Schweif“ (engl. tail)
- Kontrolle: unexponierte Zellen
- Qualitative Aussage: gentoxisch / nicht-gentoxisch
Bewertungskriterien Bioassays
- Grenzwerte = Effekt-basierte Triggerwerte (engl. effect trigger values, EBT)
- Akzeptables Level für biologische Effekte/Aktivitäten (von z.B. einer Wasserprobe)
- je nach Methodik variieren EBTs stark
- keine Übereinkunft zu entsprechenden Kriterien (aktuell internat. Diskussionen)
- gemessene Wirkung/Effekt ≠ schädigender Effekt im lebenden Organismus (oft Kompensation
möglich z.B. DNA-Reparaturmechanismen) - bei Ableitung von EBT-Werten viele Unsicherheiten vorhanden (Mischungstoxizität,
Extrapolation auf andere Organismen, u.v.m.) - WRRL: Technical Proposal for Effect-Based Monitoring and Assessment
