Bioassays Flashcards
Einleitung
bezeichnet Experimente, mit denen man die Bioaktivität von Verbindungen quantifizieren und
detektieren kann
Problematik:
Anzahl und Tonnagen von Stoffen steigen weltweit rasant. (über 275 Millionen
Chemikalien & Gemische registriert)
- Zunahme der Chemikalienbelastung in der Umwelt
o Anstieg der Diversität und des Volumens an Substanzen
o Belastungen mit bekannte und „emerging contaminants“ („neue“ gestaltete
Substanzen: bioakkumulierende → mobile Stoffe; Langkettige PFAS ersetzt durch
kurzkettige PFAS)
o chronische Belastung mit niedrigen Konzentrationen mit vielen Substanzen
o Nicht alle Stoffe messbar - Mischungstoxizität / Kombinationswirkungen
o unter Nachweisgrenze möglich
o Die Mischung „wirkt“ (Mischungstoxizität) - Regulatorik
o Einzelstoffbewertung: REACH, WRRL
o Vielzahl an Spurenstoffen gibt es keine Grenzwerte
o keine Risikobewertung für Mischungen - Limitierungen der Reinigung (Kläranlagen)
Exposition:
gegenüber einer Vielzahl an Substanzen durch einen oder mehrere Expositionswege
Wozu Wirkungen quantifiziert?
Es ist unmöglich alle Stoffe in der Umwelt zu erfassen und zu quantifizieren, „reale“ (Summen-)
Wirkungen messen, Vorteil mit Bioassays kann man Effekte auf unterschiedlichem Niveau messen
Überblick: welche Wirkungen? Werktests
- Bioassay in-vitro und in-vivo: quantifizieren die Toxizität von Umweltproben unter definierten
Laborbedingungen (auf zellulärem oder individuellem Level) - Effekt Biomarker: zeigen die biologischen Reaktionen auf individueller oder niedrigerer
Organisationsebene bei Organismen an. - Ökologische Indikatoren: weisen die Effekte auf der Ebene von höheren biologischen
Organisationsebenen nach.
Überblick - welche Schadwirkungen
- zytotoxische Wirkungen: schädigende Wirkung auf die Zelle
- gentoxische Wirkungen: schädigende Veränderungen des Erbguts - DNA
- endokrine Wirkungen: schädigende Wirkungen auf das Hormonsystems
- krebserzeugende Wirkungen: Krebsauslösung (verringerte Lebensdauer, …)
- neurotoxische Wirkungen: schädliche Wirkungen auf das Nervensystem
Vorraussetzung für die Verdwendung - Bioassays, in vitro
- relevant: Verbindung zw. molekularem Ereignis u. einem schädigenden Effekt
- Standardisierung: der analytischen Methode nach ISO / CEN / DIN / OECD, damit sind Ergebnisse
von unterschiedlichen Labors vergleichbar und Aussagekraft ist bestätigt / anerkannt - Ergebnisse müssen bewertbar sein, Verfügbarkeit von in-vitro Ergebnissen und relativen
Wirkpotenzen
Bioassasy in vitro, CALUS
- kommerzielles System
- Chemically Activated Luciferase eXpression
- in-vitro Reportergen Bioassay (Luciferase)
- Human- oder Säugertierzelllinie
- Vielzahl an möglichen Wirkungen können quantifiziert werden (DNA-Schäden, DNA-
Reparatur, oxidativer Stress (Nrf2-CALUX), …)
Bioassays, CALUX Systeme - Testprinzip
- Rezeptor bindet an natürliche oder exogene synthetische Substanz
- Aktivierung eines Reportergens (Enzym = Luciferase)
- Luciferase setzt Substrat Luciferin um → leuchtet (Lichtintensität ~ Menge an Rezeptor
gebundenem Substrat) - Testdauer 3 Tage (Expositionszeit 24 h)
- Geeignet für: Umweltproben, Einzelstoffe, …
… in-vitro, CALUX® Systeme – Auswertung:
Standardkurve messen und auswerten, Umweltproben messen, Summenwirkung aus „Östrogen“
Agonisten und Antagonisten (mit unterschiedlich potenter Wirkung), Berechnung der
Äquivalenzwerte anhand der Standardwerte, Ergebnisse in Form von 17β-Östradiol Äquivalenten (z.B.
in Kläranlagenzulauf 0,14 μg/L EEQ)
Bioassays, in-vitro, cytotox-CALUX®:
Zelltod: humane Zelllinie (U2OS)
- konstitutive Expression der Luciferase
- Abnahme der Lucifierase Aktivität → Zytotoxizität
- Kontrolle für alle Bioassays, welche U2SO2 Zelllinie
verwenden& gentoxische Assays
Bioassays, in vitro, AMES test
- Probe darf nicht zytotoxisch ein
- erstes Screening auf gentoxisches Aktivität
- je mehr his + Revertanten, desto mehr “mutagener” die Probe
- Probe ist mutagen oder nicht mutagen?
- Testsystem umfasst negativ und positive Kontrollen
Endpunkte: Anzahl der Reveranten pro Platte - Spontane Mutation in neg. Kontrolle = Hintergrund
Bioassays, in-vitro, umuC-Test (Aktivierung der DNA-Reparatur)
Testorganismus: Wirkung / Effekt: Aktivierung des SOS-Reparatursystems der Zelle (Basenaustausch, frameshift,
Deletionen, …)
Testprinzip: gentechnisch verändertes Bakterium, eine gentoxische Substanz induziert umuC-Gen, an
diesem ist ein Reportergen LacZ = Enzym gekoppelt. Enzym (β-Galactosidase) kann Farbstoff
umsetzen.
Relevanz: Nachweis von DNA-Schädigung (mit / ohne Leberextrakt)
Testdauer: 1.5 Tage (Expositionszeit: 2 Stunden)
Bioassays, in-vitro, COMET-Assay
- Gentoxizitätstest – Nachweis von DNA-Schäden
- Indikatortest – erfasst werden Effekte, die häufig parallel zu Mutationen induziert werden
- DNA-Läsionen müssen nicht zwingend zu Mutationen führen, da auch Reparatur möglich ist
- Zellen werden exponiert und dann in Gel (Agarose) eingebettet, DNA der Zellen wandert in einem
elektrischen Feld im Gel zur Kathode - Nachweis mittels Gelelektrophorese und Farbstoff
- Intakte DNA „Kopf“ (engl. head), fragmentierte DNA „Schweif“ (engl. tail)
- Kontrolle: unexponierte Zellen
- Qualitative Aussage: gentoxisch / nicht-gentoxisch
Bewertungskriterien Bioassays
- Grenzwerte = Effekt-basierte Triggerwerte (engl. effect trigger values, EBT)
- Akzeptables Level für biologische Effekte/Aktivitäten (von z.B. einer Wasserprobe)
- je nach Methodik variieren EBTs stark
- keine Übereinkunft zu entsprechenden Kriterien (aktuell internat. Diskussionen)
- gemessene Wirkung/Effekt ≠ schädigender Effekt im lebenden Organismus (oft Kompensation
möglich z.B. DNA-Reparaturmechanismen) - bei Ableitung von EBT-Werten viele Unsicherheiten vorhanden (Mischungstoxizität,
Extrapolation auf andere Organismen, u.v.m.) - WRRL: Technical Proposal for Effect-Based Monitoring and Assessment
Bioassays Interpretation
- UQN ≠ EBT
- in-vitro ≠ in-vivo (Toxikokinetik)
- Unterschiede zwischen Spezies
- schädigender Effekt auf Organismen, beeinflusst durch biotische/abiotische Faktoren
- verschiedene molekulare Ereignisse können zu einem gemeinsamen adversen Effekt führen
- je besser die Ursache der Toxizität, also die einzelnen Schritte bis zum Auftreten des Effektes (AOP,
adverse outcome pathway), desto leichter ist die Interpretation des in-vitro Bioassays und damit auch
der EBTs - kenne nur die Summe, nicht aber die indiv. Beteiligungen zur Summe
B Bsp
BMLRT,2021
- Pilotstudie
- 9 ARAs (Zu- und Ablauf)
- 8 Fließgewässer
- 15 in-vitro Tests
- Ergebnisse: ARA: Wirkungen in 13 von 15 Zuläufen, Wirkungen reduziert in Abläufen (ca. 50 –
90%), Oberflächengewässer: Wirkung in 10 von 15 Proben, meist geringer als in Abläufen,
Vergleich mit ETB soweit vorhanden
Anwendungen
Bioassays geeignet, um chemische Analytik zu ergänzen, CALUX und kombinierter Algentest gut
interpretierbar, da quantitative Aussagen möglich und Bewertungskriterien vorhanden sind
Forschungsbedarf:
o Einheitliche ETB-Werte definieren
o Standardisierung der Verfahren bei der Herleitung der EBT-Werte
o Definition von substanz- und testspezifischen relativen Wirkpotenzen für Spurenschadstoffe (REP)
o Wechselwirkungen von Substanzen
Ausblick NAM
- in-silico, in-vitro, in-vivo (NAM - Batterie) → Verbesserung der Risikobewertung
- NAM-Anwendung im Biozid- und Chemikalienrecht
- Vorteil: weniger Tierversuche, effiziente Nutzung der Ressourcen
- NAM spielen in European partnership for the assessment of risks from chemicals (PARC) eine
wichtige Rolle; im Rahmen des Projektes sollen Risikobewertungen beschleunigt werden
Wissenslücken gefüllt werden - Integrated Chemical Environment
