BCG Flashcards
Plasmide
als Vektoren eingesetzt
- Zirkuläre DNA, 2-15 kb
mit: Replikationsursprung, Resistenzgen, Klonierungsstelle
es gibt low copy (
und high copy (
Bakteriophagen
Bakteriophagen,meist kurz als Phagen bezeichnet,
sind bakterienspezifische Viren, die sich auf
Kosten der Bakterien vermehren
Dazu schwimmt
der Phage im Kulturmedium, bis er auf ein Bakterium
trifft, das er infizieren kann, um dann dessen
Vermehrung lahmzulegen und es stattdessen dazu
zu bringen, viele neue Phagen zu produzieren. Am
Ende lysiert, d. h. zerplatzt das Bakteriumund setzt
die neuen Phagen ins Kulturmedium frei, wo der
Spaß aufs Neue beginnt.
Phagen sind, anders als die Plasmide, kein Bestandteil
des Bakteriums, sondern eigenständige
(Halb-)Organismen.
LB-Medium
steht für: (engl. lysogeny broth)
Hefeextrakt (5 g/l)
Trypton (10 g/l) (Gemisch aus Peptiden und Aminos.)
Natriumchlorid (0,5–10 g/l)
Agar
auch Chinesische oder Japanische Gelatine genannt, ist ein Galactose-Polymer (ein Polysaccharid), das Gallerte bilden kann. Die Grundeinheiten des Agars sind Agarose und sulfatiertes Agaropektin.
Als Nährmedium:
Da die Mikroorganismen sich nicht frei im Medium verteilen können, bilden sie bei ihrer Vermehrung um jeden auf oder im Nährmedium befindlichen Mikroorganismus eine sichtbare Kolonie.
Plasmid-Präparation
- Im ersten Schritt stellt man ein krudes
Bakterienlysat her, indem man die bakterielle Zellwand mehr oder weniger elegant knackt und die
so entstandene Brühe einer ersten Reinigung unterzieht. –> Bspw. Alkalische Lyse
Dabei entledigt man sich eines Großteils
der bakteriellen Proteine und Membranen, wobei
man gleichzeitig das bakterielle Genom los
wird, weil die chromosomale DNA aufgrund ihrer
Größe, Struktur und Verankerung gemeinsam mit
den Zellresten abzentrifugiert wird
endgültige Reinigung derDNA, beiderman
sich der RNA und der verbliebenen Proteine entledigt,
findet in einem zweiten, separaten Schritt
statt;
high und low copy Plasmide
Die Plasmidkopienzahl beschreibt die Zahl an Plasmiden einer Art pro Zelle.
Der Replikationsursprung entscheidet über die
Zahl der Plasmidkopien, die ein Bakterium enthält.
Sind es weniger als zwanzig, bezeichnet man
es als low-copy-Plasmid, während richtige highcopy-
Plasmide in mehreren Hundert Kopien je
Bakterium vorliegen können. Üblicherweise verwendetman
high-copy-Plasmide, weil die Ausbeute
bei Plasmidpräparationen höher ist, doch kann die
große Kopienzahl manchmal hinderlich sein.
Man unterscheidet zwischen
low-copy Plasmidkopienzahl zwischen 1 und 12 pro Zelle
medium-copy Plasmidkopienzahl zwischen 15 und 20 pro Zelle
high-copy Plasmidkopienzahl zwischen 20 und 700 pro Zelle
Die Unterschiede in der Kopienzahl entstehen durch die unterschiedliche Funktionsweise des origin of replication und der in ihm codierten Gene.
Genexpression
auch kurz Expression oder Exprimierung, bezeichnet, im weiten Sinn, wie die genetische Information – eines Gens (Abschnitt der DNA) – zum Ausdruck kommt und in Erscheinung tritt, also wie der Genotyp eines Organismus oder einer Zelle als Phänotyp ausgeprägt wird.
Im engeren Sinn wird unter Genexpression die Biosynthese von Proteinen anhand der genetischen Information mitsamt allen dafür nötigen vorangehenden Prozessen verstanden, beginnend mit der Transkription als Synthese von RNA.
Endonukleasen
Restriktionsendonuklease
Nuklease/Enzyme für Abbau von Nukleinsäuren, die ein Substrat (DNA und/oder RNA) durch Spaltung einer inneren Phosphodiesterbindung abbaut, also nicht endständig spaltet. Das bedeutet auch, dass im Gegensatz zu Exonukleasen als Reaktionsprodukte kein einzelnes Nukleotid, sondern immer Mehrfachnukleotide entstehen.
Restriktionsenzyme, genauer auch Restriktionsendonukleasen (REN), sind Enzyme, die DNA an bestimmten Positionen erkennen und schneiden können. Restriktionsendonukleasen treten unter anderem in Bakterien und Archaeen auf[1] und dienen dort der Phagenabwehr. Die Restriktionsenzyme erkennen fremde DNA am fehlenden Methylierungsmuster oder an einer sonst nicht vorkommenden DNA-Sequenz und hydrolysieren dann die Fremd-DNA.
Diese Schnitte im Zucker-Phosphat-Rückgrat der DNA ent-stehen jedoch nicht beliebig, sondern nur an Stellen mit genau definierter DNA-Sequenz (Restriktionsendo-nucleasen), die für jedes Enzym spezifisch ist. Diese Sequenzen sind oft sechs Basenpaare lang, es gibt aber zahl-reiche Ausnahmen.
Klonierung
Man verdaut Vektor und DNA-Fragment, reinigt
sie, ligiert sie miteinander und transformiert die
wilde Mischung, die dabei entsteht, in Bakterien.
Anschließend muss man nur noch unter den Bakterien
eines mit dem gewünschten Klon selektieren
und fertig ist die Klonierung. Die Schwierigkeiten
liegen im Detail…welcher Vektor, welches DNA-Fragment,
Klonierung (oder Klonieren, engl. molecular cloning) ist in der Molekularbiologie der Überbegriff für Methoden zur Gewinnung und identischen Vervielfältigung von Desoxyribonukleinsäure (DNA). Im Gegensatz zum Klonen, dessen Ziel in der Herstellung genetisch identischer Organismen besteht, beschränkt sich die Klonierung auf die Herstellung identischer Moleküle der DNA.
Beim Klonieren werden sogenannte Vektoren („Genfähren“) verwendet. Diese dienen als Transportmittel zur Übertragung einer bestimmten DNA-Sequenz (genannt Transgen oder engl. insert) in eine Empfängerzelle und dessen Vervielfältigung. Um diese Vektoren für Fremd-DNA aufnahmefähig zu machen, gibt es verschiedene Verfahren:
Restriktion und Ligation
- Klonierung
ein Plasmid (beispielsweise pUC19) im Zuge eines Restriktionsverdaus mit Hilfe von speziellen Restriktionsenzymen versetzt geschnitten, so dass überhängende Enden (engl. sticky ends, klebrige Enden) entstehen
der zu inserierenden DNA handelt es sich um ein Fragment, das mit denselben Enzymen aus einem anderen Vektor isoliert wurde, um synthetische DNA mit den passenden Überhängen oder um mittels Polymerase-Kettenreaktion (PCR) aus genomischer DNA oder cDNA amplifizierte DNA.
–> komplementäre Enden an Vektor- und Ziel-DNA
Die zueinander kompatiblen, überhängenden Enden von Vektor- und Ziel-DNA finden sich und hybridisieren miteinander.
Ligation, die durch eine DNA-Ligase (z. B. T4-DNA-Ligase) katalysiert wird, werden die Enden der Einzelstränge miteinander kovalent verbunden
Nach der anschließenden Transformation werden rekombinante Bakterien durch Plattieren auf Agarplatten mit einem geeigneten Antibiotikum selektioniert. Wenn die Vektoren dies erlauben, werden mittels Blau-Weiß-Screening Kolonien ausgemustert, die kein Insert enthalten. Auch damit ist noch nicht gesichert, dass alle anderen Kolonien das gewünschte Insert enthalten. Daher wird die DNA einzelner Kolonien mittels Restriktionsverdau oder Kolonie-PCR charakterisiert.
colony PCR
molekularbiologische und biochemische Methode zum Nachweis von bestimmten DNA-Sequenzen in Kolonien von Bakterien oder Pilzen durch eine Variante einer Polymerasekettenreaktion
verwendet als DNA-Vorlage keine gereinigte Plasmid-DNA oder chromosomale DNA, sondern aus dem Kulturmedium entnommene Bakterienkolonien. Bei Plasmiden mit hoher Kopieanzahl reichen bereits wenige Zellen aus
Nach der PCR erfolgt meistens eine Analyse der vervielfältigten DNA per Agarose-Gelelektrophorese, gelegentlich auch eine DNA-Sequenzierung
PCR-Primer
Länge, Schmelztemperatur
18-30 Basen, 40-60% Guanin/Cytosin Schmelztemperatur (Tm) hängt von... - Anzahl Basenpaare - Anteil C/G-Paaren Ionenstäre der Lsg
Entscheidung welcher Vektor bei Klonierung
Verdaut man den Vektor mit zwei Restriktionsenzymen,
setzt man ein kleines Stück Polylinker
frei, das bei der anschließenden Ligation stört, weil
so kleineDNA-Fragmenteweit besser in denVektor
ligiert werden als das Fragment, dasman eigentlich
hineinbekommen möchte. Ist das Polylinkerstückchen
kürzer als 10–15 Basen, wird man es bei der
Ethanolfällung los, ist es länger, sollte man das
Vektorfragment über eine Gelelektrophorese
Wenn man den Vektor mit nur einem Restriktionsenzym
schneidet, entstehen zwei kompatible
Enden, die wieder miteinander ligieren können.
ATP
Adenosintriphosphat, kurz ATP, ist ein Nukleotid, nämlich das Triphosphat des Nucleosids Adenosin.
Adenosintriphosphat ist der universelle und unmittelbar verfügbare Energieträger in Zellen und wichtiger Regulator energieliefernder Prozesse. Das Molekül des Adenosintriphosphats besteht aus einem Adeninrest, dem Zucker Ribose und drei Phosphaten.
Muss zugegeben werden bei Ligation!
T4-DNA-Ligase funktioniert nur damit.
Aufbau von Plasmiden
- Replikationsursprung
- Selektionsgen (meist Antibiotikumresistenzgen)
- Klonierungsstelle (cloning site)
Darüber hinaus kann noch eine Menge
anderer Sequenzen drinstecken, beispielsweise
ein zweiter Selektionsmarker oder ein Promotor
zwecks Expression des eingeschleusten Gens.
- üblicherweise 2,5–5 kb
lang, je nachdem, was sie so an Eigenschaften besitzen.
Der Replikationsursprung entscheidet über die
Zahl der Plasmidkopien, die ein Bakterium enthält.
Sind es weniger als zwanzig, bezeichnet man
es als low-copy-Plasmid, während richtige highcopy-
Plasmide in mehreren Hundert Kopien je
Bakterium vorliegen können. Üblicherweise verwendetman
high-copy-Plasmide, weil die Ausbeute
bei Plasmidpräparationen höher ist, doch kann die
große Kopienzahl manchmal hinderlich sein.
Klonierungsstelle enthält Schnittstellen, die
in der Regel nur einmal im Vektor vorkommen.
