Aula 4

Question 1

Que tipo de NGS permite a sequenciação dos maiores fragmentos? Quais as desvantagens?

Answer 1

Roche 454 - permite amplificação de fragmentos grandes mas é também muito cara (precisa de 4 enzimas) e demora muito tempo.

Question 2

A técnica de Ion turrent é baseada em que processo?

Answer 2

Libertação de um H+ quando a adição de um nucleótido ocorre (medição de pH)

Question 3

A que veio responder a third-generation sequencing?

Answer 3

Uma necessidade de uma sensibilidade maior - poder detetar mutações em clones (certeficar-se que todas as moléculas são detetadas)

Question 4

(sequenciação) Como funciona o nanopore?

Answer 4

Transportador incorporado numa camada consegue amplificar ao mesmo tempo que transporta uma strand de DNA. Os dNTPs têm uma tag que ao passar pelo poro alteram a currente - podendo ser medido.
Consegue fazer reads longos, deteção em tempo real, versátil e custo eficiente

Question 5

(sequenciação) Como funciona o Illumina

Question 6

Que moléculas conseguem sequenciar o nanopore?

Answer 6

DNA e RNA

Question 7

Que vantagem tem a Illumina atualmente

Answer 7

Está muito presente na prática cliníca (muito standartizada), e é mais barata e rápida do que por exemplo a roche

Question 8

No que se baseia Sanger sequencing?

Answer 8

Amplificação com 5% de ddNTPs (que não permitem a elongação da sequência) marcados com 4 fluoróforos diferentes. os fragmentos vão ter comprimentos diferentes com fluoróforos diferentes que podem ser ordenados em eletroforese capilar. A polimerase é alterada.

Question 9

Quando é que o sequenciamento não é recomendado num contexto clínico?

Answer 9

1) Urgent diagnostics
2) When we do not know which gene or genes are associated with the phenotype
3) When the number of genes to analyse is too high
4) When the size of a gene is very high, no hot spots for mutations,
and the disease is rare.
(qPCR é mais rápido)

Question 10

Qual é a pipeline de next generation sequencing?

Answer 10

• Preparação da biblioteca
• Amplificação
• Sequenciação
• Análise dos dados

Question 11

Como é feito a clonal amplification em NGS?

Answer 11

Emulsion PCR ou Bridge PCR

Question 12

Em que se baseia a Roche 454 Pyrosequencing (NGS)

Answer 12

• fragmentos estão imobilizados com biotina
• DNA polimerase amplifica os fragmentos
• sulfurilose usa o PP1 libertado para formar ATP
• ATP é usado pela luciferase para transformar luciferina em oxiluciferina
• a oxiluciferina é quimioluminescente e é detetada
• Só um dNTP é fornecido de cada vez
• a pirase degrada os dNTPs não incorporados
• Pode ser feita em partículas em emulsão (Emulsion PCR)