Aula 2 Flashcards
Qual a diferença entre uma mutação e um polimorfismo?
A incidência na população
No que toca a alterações genéticas, quais são os dois tipos de análises que podem ser feitas?
Genotipagem de mutações e alteração da expressão genética (variação do número de cópias)
Quais os elementos importantes na identificação de amostras?
- nome do paciente, idade, hospital record (o manuseamento das amostras no contexto
- nome do médico
- tipo de amostra
- código do procedimento
- data e hora da colheita
- teste pretendido
que agentes são usados nas amostras de sangue e medula e porquê?
- Agentes anticoagulantes com Ca para impedir a cascata que leva à coagulação e a libertação de hemoglobina. EDTA para biologia molecular e heparina para análises citogenéticas (inibidor da reação de PCR)
- misturas que evitem a lise celular
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O que é FTA?
Papel usado para recolher amostras de sangue e conservá-las a temperatura ambiente
A que temperaturas devem ser conservadas as amostras?
- evitar congelar (leucócitos podem ser conservados a -80 mas RBC não)
- Para extração de DNA: - 2-8 para a análise dentro de 72 horas, -20 (não recomendado) e a -80 para períodos longos (também não é muito recomendado)
- Para o RNA: - preferível a -80 (onde o RNA fica mais conservado), -20 para períodos de 2-4 semanas e 2-8 e 22-25 para períodos inferiores a 2 horas
Para que serve RNA latter?
apenas para quando é pretendida extração de RNA e permite a durabilidade do RNA por 12 dias a 18-25ºC ou 14 dias a 2-8ºC, sem a necessidade de separação prévia das células; deve ser utilizada uma proporção de 1 de amostra para 4 de RNA latter; amostra deve ser colocada nesta solução logo na altura da recolha
Quais são os usos de tecidos em parafina e o que ter em consideração?
Diagnose genética, doenças infeciosas, testes de identidade
Fixação em formalina neutra ou paraformaldeído (substituí o formol na conservação de células, uma vez que, ao contrário deste, não destrói os ácidos nucleicos) recomendada
Mercúrio e outros metais pesados não são aceitáveis, uma vez que quebram os ácidos nucleicos
As secções de tecidos fixadas em lâminas podem ser usadas para extracção de DNA ou RNA (remoção da parafina com xileno, lavagens de etanol, lise de tecidos e extração de DNA/RNA)
O que ter em consideração na escolha da metodologia da extração de ácidos nucleicos?
Velocidade de processamento
Facilidade de uso
Rendimento de DNA e RNA
Qualidade doa ácidos nucleicos
(performance na amplificação)
Armazenamento
Segurança de qualidade
Custo
Quais os passos fundamentais para a extração de DNA de amostra de sangue?
- separação dos glóbulos brancos
- lise das células
- digestão proteica com ProK
- Separação das proteínas do DNA
- Precipitação do DNA (alcool)
- Rehidratar o DNA
Quais os passos fundamentais para a extração de RNA de amostra de sangue?
- Separação das WBCs
- Lise das WBCs (uso de agentes desnaturantes devido às RNAses)
- Separação de proteínas, DNA etc
- Precipitação do RNA
- Ressuspender em DEPC-treated water
Quais são alguns dos parâmetros para avialar qualidade e integridade do RNA.
- proporção 28S rRNA : 16S rRNA deve ser 2:1
- RIN number>6-7
- não haver DNA genómico (apenas uma banda de peso elevado)
O que fazer com o DNA e RNA em diagnóstico em genética medicinal
DNA: amplificação (PCR), sequenciação, técnicas de hibridação (ex: southern blot), digestão com enzimas de restrição
RNA:amplificação (RT_PCR), técnicas de hibridação (microarrays), quantificação (qPCR)
Qual o conceito base do multiplex PCR?
mais do que 1 framento de DNA amplificado ao mesmo tempo, cada um com o seu par específico de primers
O que é RFLP-PCR e quando se usa?
é baseado na hidrólise do DNA por enzimas de restrição. Quando a zona de reconhecimento é mutada, deixa de ser reconhecida e não há hidrólise do DNA.
Usada quando os genes tê, poucas mutações associadas
Em que se baseia o allelle specific amplification (PCR-ASO)?
Uso de um primer forward diferente para cada alelo e um primer reverse comum. Como as diferenças podem ser de apenas uma base as condições foram optimizadas para apenas existir annealing de alta afinidade. Na amplificação é possível ver se ouve amplificação de cada um dos alelos.
Muitas vezes pode haver falta de amplificação então é necessário um controlo de amplificação.
No que se baseia o amplification refractory mutation system (PCR-ARMS)
Uso de primers externos e outro conjunto de primers internos (um complementar ao alelo wild type e outro complementar ao mutado). Assim o comprimento do fragmento vai depender de qual dos priemrs internos se ligou e da am plificação resultante. É suposto observar a amplificação dos externos mais um ou dois dos internos.
A que tipo de mutações está muitas vezes associada a leucemia?
A transcritos de fusão
No que se baseia o PCR-nested
Usado por exemplo para a CML a aprtir do cDNA dos transcritos. Usa-se um par de primers para fazer uma primeira amplificação e depois um par mais interno para fazer uma segunda amplificação.
Em que se baseia a loom-mediated isothermal amplification (PCR-LAMP)
Utilização de um conjunto de 6 primers onde nos passos não cíclicos ocorre a formação de loops nas extremidades e durante os passos cíclicos ocorre a amplificação do fragmento.
Em que se baseia a recombinase polymerase amplification (RPA)?
- Primers associados a recombinase invadem a cadeia dsDNa que é amplificada pela strand displacing polymerase enquanto a outra cadeia é estabilizada por proteínas.
- é muito rápida
- pode ser usada para amplificar RNA também ao adicionar uma transcriptase reversa
- pode ser usada em multiplex com a adição de mais primers
No que se baseia a rolling circular amplification (RCA)?
Uma molécula circular de DNA é replicada simultaneamente por mais do que uma polimerase (Super phi enzyme) com random hexamer primers. Isto resulta na produção de uma molécula de DNA muito comprida com a sequência repetida inúmeras vezes
Qual é um dos polimorfimos associado a doença mais comum?
genes associados à trombofilia - mais suscetíveris a
trombose
embolia
abortos
Arterial thrombi
Eclampsia and
preeclampsia
