Aula 3 Flashcards
No que se baseia o qPCR?
Quantitative PCR ou real time PCR é baseado na deteção do avanço da reação de amplificação a tempo real com o auxilio de fluoroforos.
O cycle treshold é um parâmetro importante (ex: quanto mais cedo, maior a expressão genética)
Como é feita a quantificação relativa em qPCR?
é usada uma expressão x = 2^-/\/\Ct.
/\Ct = Ctgene de interesse - Ctgene endógeno
/\/\Ct= /\Ctratamento - Ctcontrolo
Dá exemplos do que pode ser usado na deteção do qPCR
- agentes intercalantes da dsDNA
- SyBR green
- sondas de hibridação
- sondas de clivagem (taqman)
- “displaceable probes”
- oligonucleotidos com fluoroforos
Características do sybr green
usado em qPCR: não é especifico - liga-se a miner groove do DNA o que significa que contaminações vão ser detetadas
Como funcionam as sondas de cleavage Taqman?
A sonda tem um 5’ fluoróforo e um quencher3’ que inibe o sinal do fluóroforo. Quando uma polimerase com capacidade de displacement e exonuclease chega à sonda, degrada-a. A separação do quencher e do fluoróforo permite que o sinal do mesmo seja detetado na fase de extensão.
Como funcionam as sondas “molecular beacon”?
É uma sonda com uma estrutura de hairpin que tem um fluoróforo e um quencher. Durante a fase de annealing a estrutura de hairpin é aberta quando a sonda se liga ao DNA, afastando o quencher do fluoróforo e havendo sinal.
Como funcionam as sondas FRET (fluorescence resonance enrgy transfer)?
Há um fluoróforo dador e um recetor. O recetor só emite sinal quando perto do dador (1-5 bp). Pode ser usada em conjunto com as beacon de forma a que durante o annealing os hairpins se desfaçam e façam com que os fluoróforos fiquem próximos.
Quais são as vantagens e desvantagens do qPCR?
simples e rápido
específico e sensível
flexível
MAS é caro (equipamento e reagentes)
Em que se baseia HRM (high resolution melting)?
Serve para se ver se dois alelos são diferentes. Associa-se um agente intercalante a moléculas de DNA e desnatura-se. Quando acontece o reannealing heterodímeros não hibridam tão bem como homodímeros, logo quando a temperatura aumenta os heterodímeros libertam o agente intercalante. É barato e as conclusões tiram-se das curvas obtidas do sinal. É usado por exemplo em cardiomiopatias onde há muitos genes associados.
no que se baseia o dHPLC (denaturating high performence liquid cromatography)?
Cadeias de DNA são desnaturadas depois de amplificadas e colucadas numa coluna de cromatografia. Com a diminuição gradual de temperatura heterodímeros são iluídos mais facilmente do que homodímeros. Mede-se a absorvância a UV.
Sensibilidade e especificidade de 96-100% mas as condições têm que ser muito personalizadas aos fragmentos o que torna o processo muito time-consuming e dispendioso. Pode detetar point mutations, deleções e inserções mas é preciso ter cuidado com polimorfismos.
No que se baseia MALDI-TOF Mass Spectrometry (Matrix - Assisted Laser Desorption / Ionization - Time Of Flight Mass Spectrometry)?
Semelhante a espetroscopia de massa: o DNA é imobilizado num chip, separado por massa e um laser é incidido que mede a massa o que permite ver a diferença de uma única base ou mutação- muito sensível e preciso. Um chip tem 348 placas poçoes, cada um pode-se testar 40 mutações.
Em que se baseia o iPLEX?
uso de um software com uma base de dados onde o input são uma sequência (50nt - mutação - 50nt) e o software calcula que tipos de primers podem ficar no mesmo poço (num poço podem ser analisados 40 mutações em cada um dos 348 poços) e o output são a lista de primers e os poços onde são usados. São usados 2 primers mais um primer iPlex adjacente à mutação. é usada uma fosfatase alcalina e uma exonuclease tipo 1 para degradar os dNTPs usados na reação.
são usados ddNTPs para se amplificar apenas um nucleótido. o fragmento vai ter o comprimento de primer+1
é obtido um espetro em que cada plex é uma mutação
Como se interpreta os resultados de um iPlex
É gerado um gráfico em que a diagonal é hetorozigotismo e o resto é homozigotia (horizontal-normal e vertical-mutado). No espetro há os picos de massa em que a mudança de um nucleótido é diferente para alterar a massa.
Em que se baseia MLPA (multiple Ligation probe amplification)?
É um tipo de PCR multiplex mas usa primers universais.
Permite detetar deleções e inserções mas também pode mutações pontuais com kits especificos.
os primers usados têm uma stuffer sequence com tamanho variável para se poder distinguir e uma zona complementar. São construídos de forma a terem 1 base de distância - se houver uma deleção eles não se ligam. O mismatch faz com o produto não seja amplificado (não aprece no gráfico, se for heterozigótico aparece com metade do tamamnho)
No que se baseia o Droplet DIGITAL PCR
Foi desenhado para detetar mutações em quantidade pequena num background de wild type (como acontece em cancros) mas também deteta variação do número de cópias, mutações, expressão de genes.
Cda molécula é inserida num guticula onde será amplificada
Maior resolução quantitativa que o PCR (10x)
Maior sensibilidade que o PCR (100x)
