ARN non-codants et technologies de l'ADN

Question 1

Est-ce que tous les ARN non-codants ont des fonctions dans la régulation de l’expression des gènes ?

Answer 1

Non
Les miRNA, siRNA et lncRNA régulent l’expression des gènes. Or, certains miRNA et siRNA jouent un rôle dans la défense des cellules contre les virus et transposons : ce sont les RNAi

Question 2

Que sont les RNAi

Answer 2

Le RNAi (miRNA et siRNA) est un processus biologique dans lequel les molécules d’ARN inhibent l’expression ou la traduction des gènes, en neutralisant les molécules d’ARNm ciblées
- Applications thérapeutiques et en recherche

Question 3

Quelles sont les ARN polymérases impliquées dans la biosynthèse des ARN non-codants ?

Answer 3

Les gènes de ARN non-codants (autant miRNA que lncRNA) sont d’abords transcrits comme s’ils étaient des ARNm, donc via ARN polymérase II

Question 4

Quelles sont les différences entre miRNA et lncRNA ?

Answer 4

Les lncRNA sont des transcrits de plus de 200 nucléotides alors que les miRNA sont plus petits (mais il s’agit d’une définition arbitraire). Les lncRNA ont aussi une expression spécifique ++ dans certains tissus

Question 5

Quelles sont les étapes de la biogénèse des miRNAs DANS LE NOYAU?

Answer 5

1- ARN polymérase II fait la transcription
2- Transcrit est coiffé, épissé et polyadénylé (comme si c’était un ARNm)
3- Les miRNA font partie du pri-miRNA, un transcrit précurseur qui contient un ou plusieurs miRNA
4- Chaque structure ARN double brin des hairpin dans le pri-miRNA est reconnue par DGCR8
5 - DGCR8 et Drosha (enzyme) forment le complexe microprocesseur
6- Cropping : Drosha découpe et libère les pré-miRNA du pri-miRNA
7- Le pré-miRNA est reconnu et exporté par Exportin-5

Question 6

Quelle est la différence entre pré-miRNA et pri-miRNA ?

Answer 6

Un seul pri-miRNA contient plusieurs précurseurs de miRNA, qui sont nommés pré-miRNA
- Chaque pré-miRNA a une structure en tige-boucle (hairpin)

Question 7

Comment Exportin-5 reconnaît-elle le pré-miRNA ?

Answer 7

L’enzyme Dosha laisse deux nucléotides non-appariés à l’extrémité 3’ ; Exportin-5 les reconnaît

Question 8

De quelle protéine dépend le transport du pré-miRNA vers le cytoplasme ?

Answer 8

Dépend de la protéine Ran liée au GTP (Ran-GTP)

Question 9

Décrire les étapes de la biogénèse des miRNAs dans le CYTOPLASME

Answer 9

Dicing : l’épingle à cheveux (hairpin) est processée par Dicer, une endoribonucléase qui coupe la boucle : donne un duplex miARN:miARN* (environ 22 nucléotides de long)
- miARN est nommé brin guide
- miARN* est nommé brin passager

Question 10

Quel brin du duplex miARN:miARN* est utilisé pour être fonctionnel ? Comment?

Answer 10

La molécule Argonaute choisit seulement le brin guide (miRNA) bien que l’un ou l’autre des brins pourrait être fonctionnel

Question 11

Qu’est-ce que le RISC ?

Answer 11

RISC pour RNA-Induced Silencing Complex : Argo + brin guide + autres protéines
- Permet au miRNA d’agir

Question 12

Distinguer les lncRNA intergénique et antisens

Answer 12

• lncRNA intergénique : localisé dans une région entre des gènes
• lncRNA antisens : sont transcrits dans la direction opposée d’un gène codant, la séquence du lncRNA chevauche (en partie ou au complet) le gène codant

Question 13

Distinguer les lncRNA introniques et divergeants

Answer 13

• lncRNA introniques sont dans un intron d’un gène codant
• lncRNA divergents sont transcrits de façon divergeante au promoteur d’un gène codant (antisens mais sans chevauchement avec les gènes)

Question 14

Quelles sont les fonctions cellulaires des ncRNA ?

Answer 14

• Contrôler l’expression des gènes (positivement ou non) voisins ou très loin. Cette régulation se fait a/n transcriptionnel, post-transcriptionnel et épissage
• Modification d’histones, formation d’hétérochromatine, ciblage de la méthylation
• Épigénétique
• Défense cellulaire contre les séquences nucléotidiques parasitaires (RNAi)

Question 15

Quelles sont les utilités des ncRNA en médecine ?

Answer 15

• Utilisation des RNAi synthétiques (siRNA) pour inhiber de manière sélective et robuste l’expression de gènes d’intérêt spécifique
• En activant ou inhibant des gènes, les ARN non-codants peuvent être impliqués dans plusieurs pathologies

Question 16

Quelle est la caractéristique la plus saillante des enzymes de restriction ?

Answer 16

Coupent l’ADN bicaténaire à des endroits caractérisés par des séquences nucléotidiques spécifiques (sites de restriction)

Question 17

À quoi servent les enzymes de restriction chez les bactéries ?

Answer 17

Défense contre les bactériophages en coupant l’ADN étranger en morceaux

Question 18

Quels types de séquences sont reconnues par les enzymes de restriction ?

Answer 18

Séquences palindromiques : se lisent de la même façon dans les deux directions (gauche et droite, mais toujours 5’ vers 3’)

Question 19

Comment se nomme les fragments d’ADN qui résultent de l’action d’une enzyme de restriction ?

Answer 19

Peuvent être :
- Bouts francs = identiques de chaque côté
- Bouts collants = une portion de l’ADN est simple brin

Question 20

Sur un gel d’agarose, vers quel pôle migrent les fragments d’ADN ?

Answer 20

Migrent vers le pôle positif (car ADN chargé négativement)
- Les cellules de petite taille se déplacent plus loin que les cellules de grande taille

Question 21

Comment fait-on pour visualiser les fragments d’ADN sur un gel d’agarose ?

Answer 21

On ajoute une molécule fluorescente qui s’intercale à l’intérieur de la double-hélice (bromure d’ethidium) + rayons UV

Question 22

Peut-on liguer un fragment d’ADN avec des bouts collants avec un fragment d’ADN avec des bouts francs ?

Answer 22

Non
- L’ADN ligase peut lier deux bouts d’ADN, mais les bouts cohésifs ne sont pas compatibles avec bouts francs (car cohésifs ont une partie simple brin)

Question 23

Est-ce que c’est la ligation entre bouts francs ou entre bouts collants qui est plus efficace ? Pourquoi ?

Answer 23

Ligation de bouts collant est plus efficace (100x plus), car les bouts collants s’apparient ensemble alors que bouts francs doivent entrer en collision

Question 24

Définir ce qu’on entend par “vecteur” en bio

Answer 24

Plasmide qui a été manipulé en laboratoire dans lequel on peut insérer (cloner) des fragments d’ADN

Question 25

Quels sont les éléments importants d’un vecteur de clonage/d’expression ?

Answer 25

• Origine de réplication
• Gène de sélection : résistance à des antibiotiques (permet à la bactérie d’avoir un avantage sur les autres)
• Sites de restriction : on y insère des fragments d’ADN
• Site de multiclonage : plusieurs sites de clonage en ligne pour faciliter le clonage de l’ADN

Question 26

Pourquoi est-il important d’avoir un gène de résistance à un antibiotique dans notre vecteur ?

Answer 26

Permet d’identifier les bactéries qui ont le plasmide transformé (car ce sont les seules qui survivent si on met l’antibiotique)

Question 27

Quelles sont les composantes essentielles d’une réaction de polymérisation de l’ADN in vitro ?

Answer 27

• ADN polymérase
• Amorce : in vitro, c’est un oligonucléotide ADN ou ARN
• ADN simple brin

Question 28

Comment obtient-on l’ADN simple brin in vitro ?

Answer 28

Dénaturation thermique : on augmente la température

Question 29

Vrai ou faux ? Un ADN dénaturé (simple-brin) peut se renaturer en ADN double-brin s’il revient aux bonnes conditions

Answer 29

Vrai

Question 30

Quel composé provoque la terminaison de chaine dans la méthode de Sanger ? Pourquoi ?

Answer 30

Un didéoxyribonucléotide : il n’a pas de O sur son carbone 3’, ce qui l’empêche de former un lien phosphodiester

Question 31

En quoi la méthode de Sanger permet le séquençage de l’ADN ?

Answer 31

Comme le didéoxyribonucléotide arrête la polymérisation, on peut trouver quelle base est présente à l’endroit où la chaîne s’est arrêtée (base complémentaire au ddNTP). Comme ce processus est aléatoire, au final on va pouvoir séquencer tout l’ADN

Question 32

Quelles sont les 3 étapes d’un cycle de réaction PCR ?

Answer 32

1- Séparation des brins d’ADN (95 degrés)
2- Hybridation des amorces (55 degrés)
3- Synthèse par Taql polymérase (72 degrés)

Question 33

À quoi sert la PCR ?

Answer 33

Produire ++++ d’ADN à partir de quelques molécules

Question 34

Dans une réaction PCR, combien de molécules d’ADN on obtient, à partir d’une seule molécule, après 10 cycles ? 20 cycles ? 30 cycles ?

Answer 34

Si on part à une seule copie :
- 1024 copies après 10 cycles (mille)
- 1 048 576 après 20 cycles (1 million)
- 1 073 742 842 après 30 cycles (1 milliard)

Question 35

Quelles sont les différences entre VNTR et STR ?

Answer 35

Les deux sont des séquences tandem répétées :
- STR : 2 à 6 nucléotides, séquence répétée de 5 à 200x dans le même locus
- VNTR : 10 à 100 nucléotides, séquence répétée de 10 à 1500x dans le même locus

Question 36

Comment peut-on déterminer l’identité d’un individu en laboratoire en utilisant un échantillon contenant de l’ADN ?

Answer 36

Le nombre de STR et VNTR dans un même locus varie pour chaque individu : on peut donc comparer les séquences d’un suspect (ex. goutte de sang) à des séquences ADN connues et on cherche une correspondance.
- Utile en médecine légale ou pour test de paternité

Question 37

Quelle est la différence entre SNP et mutation ?

Answer 37

• Les SNP (polymorphisme d’un nucléotide) représentent 90% des variations génétiques humaines ; variation de base d’ADN simple trouvé chez plus de 1% de la population
• Mutation : variation de base d’ADN simple trouvée chez moins de 1% de la population

Question 38

Quelle est l’utilité des SNP liés ? Les distinguer des SNP causatifs

Answer 38

• SNPs causatifs causent un trait génétique, une maladie, différence de réponse à un traitement, etc..
• SNPs liés sont à proximité d’un gène qui cause un trait génétique, maladie, susceptibilité, différence de réponse à un traitement… Ils ne causent pas de traits mais servent de marqueurs