ARN non-codants et technologies de l'ADN Flashcards
Est-ce que tous les ARN non-codants ont des fonctions dans la régulation de l’expression des gènes ?
Non
Les miRNA, siRNA et lncRNA régulent l’expression des gènes. Or, certains miRNA et siRNA jouent un rôle dans la défense des cellules contre les virus et transposons : ce sont les RNAi
Que sont les RNAi
Le RNAi (miRNA et siRNA) est un processus biologique dans lequel les molécules d’ARN inhibent l’expression ou la traduction des gènes, en neutralisant les molécules d’ARNm ciblées
- Applications thérapeutiques et en recherche
Quelles sont les ARN polymérases impliquées dans la biosynthèse des ARN non-codants ?
Les gènes de ARN non-codants (autant miRNA que lncRNA) sont d’abords transcrits comme s’ils étaient des ARNm, donc via ARN polymérase II
Quelles sont les différences entre miRNA et lncRNA ?
Les lncRNA sont des transcrits de plus de 200 nucléotides alors que les miRNA sont plus petits (mais il s’agit d’une définition arbitraire). Les lncRNA ont aussi une expression spécifique ++ dans certains tissus
Quelles sont les étapes de la biogénèse des miRNAs DANS LE NOYAU?
1- ARN polymérase II fait la transcription
2- Transcrit est coiffé, épissé et polyadénylé (comme si c’était un ARNm)
3- Les miRNA font partie du pri-miRNA, un transcrit précurseur qui contient un ou plusieurs miRNA
4- Chaque structure ARN double brin des hairpin dans le pri-miRNA est reconnue par DGCR8
5 - DGCR8 et Drosha (enzyme) forment le complexe microprocesseur
6- Cropping : Drosha découpe et libère les pré-miRNA du pri-miRNA
7- Le pré-miRNA est reconnu et exporté par Exportin-5
Quelle est la différence entre pré-miRNA et pri-miRNA ?
Un seul pri-miRNA contient plusieurs précurseurs de miRNA, qui sont nommés pré-miRNA
- Chaque pré-miRNA a une structure en tige-boucle (hairpin)
Comment Exportin-5 reconnaît-elle le pré-miRNA ?
L’enzyme Dosha laisse deux nucléotides non-appariés à l’extrémité 3’ ; Exportin-5 les reconnaît
De quelle protéine dépend le transport du pré-miRNA vers le cytoplasme ?
Dépend de la protéine Ran liée au GTP (Ran-GTP)
Décrire les étapes de la biogénèse des miRNAs dans le CYTOPLASME
Dicing : l’épingle à cheveux (hairpin) est processée par Dicer, une endoribonucléase qui coupe la boucle : donne un duplex miARN:miARN* (environ 22 nucléotides de long)
- miARN est nommé brin guide
- miARN* est nommé brin passager
Quel brin du duplex miARN:miARN* est utilisé pour être fonctionnel ? Comment?
La molécule Argonaute choisit seulement le brin guide (miRNA) bien que l’un ou l’autre des brins pourrait être fonctionnel
Qu’est-ce que le RISC ?
RISC pour RNA-Induced Silencing Complex : Argo + brin guide + autres protéines
- Permet au miRNA d’agir
Distinguer les lncRNA intergénique et antisens
- lncRNA intergénique : localisé dans une région entre des gènes
- lncRNA antisens : sont transcrits dans la direction opposée d’un gène codant, la séquence du lncRNA chevauche (en partie ou au complet) le gène codant
Distinguer les lncRNA introniques et divergeants
- lncRNA introniques sont dans un intron d’un gène codant
- lncRNA divergents sont transcrits de façon divergeante au promoteur d’un gène codant (antisens mais sans chevauchement avec les gènes)
Quelles sont les fonctions cellulaires des ncRNA ?
- Contrôler l’expression des gènes (positivement ou non) voisins ou très loin. Cette régulation se fait a/n transcriptionnel, post-transcriptionnel et épissage
- Modification d’histones, formation d’hétérochromatine, ciblage de la méthylation
- Épigénétique
- Défense cellulaire contre les séquences nucléotidiques parasitaires (RNAi)
Quelles sont les utilités des ncRNA en médecine ?
- Utilisation des RNAi synthétiques (siRNA) pour inhiber de manière sélective et robuste l’expression de gènes d’intérêt spécifique
- En activant ou inhibant des gènes, les ARN non-codants peuvent être impliqués dans plusieurs pathologies
Quelle est la caractéristique la plus saillante des enzymes de restriction ?
Coupent l’ADN bicaténaire à des endroits caractérisés par des séquences nucléotidiques spécifiques (sites de restriction)
À quoi servent les enzymes de restriction chez les bactéries ?
Défense contre les bactériophages en coupant l’ADN étranger en morceaux
Quels types de séquences sont reconnues par les enzymes de restriction ?
Séquences palindromiques : se lisent de la même façon dans les deux directions (gauche et droite, mais toujours 5’ vers 3’)
Comment se nomme les fragments d’ADN qui résultent de l’action d’une enzyme de restriction ?
Peuvent être :
- Bouts francs = identiques de chaque côté
- Bouts collants = une portion de l’ADN est simple brin
Sur un gel d’agarose, vers quel pôle migrent les fragments d’ADN ?
Migrent vers le pôle positif (car ADN chargé négativement)
- Les cellules de petite taille se déplacent plus loin que les cellules de grande taille
Comment fait-on pour visualiser les fragments d’ADN sur un gel d’agarose ?
On ajoute une molécule fluorescente qui s’intercale à l’intérieur de la double-hélice (bromure d’ethidium) + rayons UV
Peut-on liguer un fragment d’ADN avec des bouts collants avec un fragment d’ADN avec des bouts francs ?
Non
- L’ADN ligase peut lier deux bouts d’ADN, mais les bouts cohésifs ne sont pas compatibles avec bouts francs (car cohésifs ont une partie simple brin)
Est-ce que c’est la ligation entre bouts francs ou entre bouts collants qui est plus efficace ? Pourquoi ?
Ligation de bouts collant est plus efficace (100x plus), car les bouts collants s’apparient ensemble alors que bouts francs doivent entrer en collision
Définir ce qu’on entend par “vecteur” en bio
Plasmide qui a été manipulé en laboratoire dans lequel on peut insérer (cloner) des fragments d’ADN
Quels sont les éléments importants d’un vecteur de clonage/d’expression ?
- Origine de réplication
- Gène de sélection : résistance à des antibiotiques (permet à la bactérie d’avoir un avantage sur les autres)
- Sites de restriction : on y insère des fragments d’ADN
- Site de multiclonage : plusieurs sites de clonage en ligne pour faciliter le clonage de l’ADN
Pourquoi est-il important d’avoir un gène de résistance à un antibiotique dans notre vecteur ?
Permet d’identifier les bactéries qui ont le plasmide transformé (car ce sont les seules qui survivent si on met l’antibiotique)
Quelles sont les composantes essentielles d’une réaction de polymérisation de l’ADN in vitro ?
- ADN polymérase
- Amorce : in vitro, c’est un oligonucléotide ADN ou ARN
- ADN simple brin
Comment obtient-on l’ADN simple brin in vitro ?
Dénaturation thermique : on augmente la température
Vrai ou faux ? Un ADN dénaturé (simple-brin) peut se renaturer en ADN double-brin s’il revient aux bonnes conditions
Vrai
Quel composé provoque la terminaison de chaine dans la méthode de Sanger ? Pourquoi ?
Un didéoxyribonucléotide : il n’a pas de O sur son carbone 3’, ce qui l’empêche de former un lien phosphodiester
En quoi la méthode de Sanger permet le séquençage de l’ADN ?
Comme le didéoxyribonucléotide arrête la polymérisation, on peut trouver quelle base est présente à l’endroit où la chaîne s’est arrêtée (base complémentaire au ddNTP). Comme ce processus est aléatoire, au final on va pouvoir séquencer tout l’ADN
Quelles sont les 3 étapes d’un cycle de réaction PCR ?
1- Séparation des brins d’ADN (95 degrés)
2- Hybridation des amorces (55 degrés)
3- Synthèse par Taql polymérase (72 degrés)
À quoi sert la PCR ?
Produire ++++ d’ADN à partir de quelques molécules
Dans une réaction PCR, combien de molécules d’ADN on obtient, à partir d’une seule molécule, après 10 cycles ? 20 cycles ? 30 cycles ?
Si on part à une seule copie :
- 1024 copies après 10 cycles (mille)
- 1 048 576 après 20 cycles (1 million)
- 1 073 742 842 après 30 cycles (1 milliard)
Quelles sont les différences entre VNTR et STR ?
Les deux sont des séquences tandem répétées :
- STR : 2 à 6 nucléotides, séquence répétée de 5 à 200x dans le même locus
- VNTR : 10 à 100 nucléotides, séquence répétée de 10 à 1500x dans le même locus
Comment peut-on déterminer l’identité d’un individu en laboratoire en utilisant un échantillon contenant de l’ADN ?
Le nombre de STR et VNTR dans un même locus varie pour chaque individu : on peut donc comparer les séquences d’un suspect (ex. goutte de sang) à des séquences ADN connues et on cherche une correspondance.
- Utile en médecine légale ou pour test de paternité
Quelle est la différence entre SNP et mutation ?
- Les SNP (polymorphisme d’un nucléotide) représentent 90% des variations génétiques humaines ; variation de base d’ADN simple trouvé chez plus de 1% de la population
- Mutation : variation de base d’ADN simple trouvée chez moins de 1% de la population
Quelle est l’utilité des SNP liés ? Les distinguer des SNP causatifs
- SNPs causatifs causent un trait génétique, une maladie, différence de réponse à un traitement, etc..
- SNPs liés sont à proximité d’un gène qui cause un trait génétique, maladie, susceptibilité, différence de réponse à un traitement… Ils ne causent pas de traits mais servent de marqueurs
