Aislamiento de proteínas de un proteoma Flashcards
¿Qué se necesita en primer lugar para caracterizar un proteoma?
preparar muestras puras de sus proteínas constituyentes
Medios generales que se usan para caracterizar un proteoma (2)
- tecnologías tradicionales
- métodos cromatográficos
¿En que se basa la separación de proteínas de un proteoma? combinación de dos técnicas:
- electroforesis bidimensional en geles de poliacrilamida
- espectometría de masas
Para caracterisar un proteoma es necesario separar las ____ unas de otras y luego determinar la ____ y ____ de cada una de ellas
proteínas
identidad
cantidad relativa
¿Cómo se realiza la separación de proteínas?
TÉCNICA
por electroforesis bidimensional en gel de poliacrilamida o 2D-PAGE
La separación según la carga es seguida por:
la separación según la masa
detergente usado en la técnica de electroforesis en gel
dodecilsulfato de sodio (SDS)
¿Qué hace el dodecilsulfato de sodio (SDS)?
desnaturaliza las proteínas y confiere carga negativa
es proporcional al tamaño del polipéptido desplegado
¿Cómo se separan las proteínas?
de acuerdo a susa masas moleculares
migran las proteínas mas pequeñas más rápido hacia el electrodo positivo
¿Qué resultado arroja la electroforesis bidimensional?
revela un patrón complejo de manchas; donde cada una es una proteína diferente
limitaciones de la electroforesis en gel
V/F
no todas las proteínas de un proteoma será visible en el gel debido a que una gran parte de ellas no son solubles en un tampón acuoso
verdadero
Limitaciones de la electroforesis en gel
Hay problemas con la ____ y existe dificultad para diseñar procedimiento para ____ distintos
reproducibilidad
proteomas
Limitaciones de la electroforesis en gel
V/F
puede ser cuantitativa pues puede abarcar el rango completo de concentraciones de proteínas presentes en la célula
Falso
no puede ser cuantitativa pues no puede abarcar el rango completo de concentraciones de proteínas presentes en la célula
¿Qué han hecho los avances en espectometría de masas?
han proporcionado un procedimiento de identificación rápido y preciso
¿Cuáles son los sistemas de ionización?
- mediante desorción por láser (MALDI)
- por electrospray asistido por radioactividad (ESI)
Resultado de la electroforesis en gel bidimensional
un patrón complejo de manchas y cada una representa al menos una proteína diferente
el reto es identificar las proteínas de interés entre tantas
en lugar de determinar la secuencia de aminoácidos, las proteínas o fragmentos peptídicos se separan según su…
relación masa-carga
Primera unidad de un espectrofotómetro de masas
Presenta un dispositivo de ionización que transforma los fragmentos peptídicos individuales de la fase sólida en una gaseosa
Segunda unidad de un espectrofotómetro de masas
Es una cámara de separación en la que los iones se mueven a través de un vacío de acuerdo a su carga y masa y se separan sobre la basde del tiempo de vuelo
Tercera unidad de un espectrofotómetro de masas
Es un detector con enorme sensibilidad y poder de resolución que pueda seprar los picos de miles de especies moleculares diferentes
¿Qué se le hace a las proteínas antes de ser analizadas mediante MALDI-TOF?
Se rompen en fragmentos
¿Cuál es el enfoque estándar?
- purificar la proteína de una mancha de gel
- digerirla con proteasa específica de secuencia (tripsina)
- tripsina escinde la proteín inmediato después de residuos de arginina y lisina
número aproximado de péptidos resultantes
con la mayoría de proteínas = 75 aminoácidos de longitud
Una vez ionizados, la relación masa-carga de los péptidos se determina por:
Su tiempo de vuelo (TOF) dentro del espectómetro de masas a medida que salta desde la fuente de ionización al detector
¿Qué nos permite la relación masa-carga?
Determinar la masa molecular que a su vez permite saber la composición del péptido
Si se analizan los péptidos de una única mancha de proteína en el gel bidimensional entonces la información de composición…
Puede relacionarse con la secuencia completa del aminoácido para la proteína y por lo tanto, con el gel que codifica esa proteína
¿Qué representa el pico observado por espectometría de masas?
Corresponde a un péptido
Protocolo para identificar una proteína de interés en un gel y espectometría de masas
- Selección de una mancha
- Digestión con proteasa
- Espectometría de masas
- Comparación en base de datos
¿Cómo se estiman las identidades proteicas?
A partir de los perfiles de péptidos obtenidos en el análisis de espctometría de masas
En las bases de datos se generan ____ los perfiles de péptidos que se obtendrían mediante digestión con ____ para cada uno de los genes conocidos de una especie
In silico
Tripsina
