8. Genómica Funcional / 9. Metabolómica

Question 1

Como se podem estudar interações proteína-proteína?

Que tipo de interações há?

Answer 1

(-) Método de 2 híbridos
(-) Proteínas membranares
(-) Proteínas fluorescentes
(-) Chips de proteínas

Question 2

Interações proteína-DNA

Answer 2

Permite determinar todos os alvos de um determinado fator de transcrição

ChIP (chromatin immunoprecipitation):

1. Crosslink entre o DNA e a proteína in vivo usando formaldeído
2. Lise e fragmentação
3. Isolamento do complexo proteína-DNA por imunoprecipitação
4. Amplificado + Sequenciado (ChIP-Seq)

ChIP-on-chip
Igual mas usa microarray em vez de sequenciar

Question 3

Metabolómica - protocolo

Answer 3

1. Preparação da amostra
2. Aquisição dos dados
3. Processamento de dados
4. Análise de dados
5. Interpretação biológica

Question 4

9. Metabolómica

9. 1. Preparação da amostra

Answer 4

SEM paragem de metabolismo - após o crescimento celular a amostra pode ser separada e analisada diretamente

OU

COM paragem de metabolismo (quenching) - posterior extração de metabolitos:

• colocar a amostra em gelo, etanol frio ou azoto líquido
• extração pode ser realizada por adição de etanol em ebulição, metanol, frio ácido perclórico ou água quente

Question 5

9. Metabolómica

.2 Aquisição de dados

Answer 5

MS - espetrometria de massa

• Gases
• Líquidos

NMR - Ressonância Magnética Nuclear

Question 6

Tipos de MS (Vantagens e Desvantagens)

Answer 6

Rácio massa/carga

GC-MS

• alta eficiência e tempos de retenção reprodutíveis
• obtêm resultados para todos os metabolitos

desv: limitado a compostos voláteis!

LC-MS
- não é necessário derivar compostos para análise

desv: supressão iónica

Question 7

9.2. Aquisição de dados

NMR

Answer 7

Excelente quantificação + reprodutível

Boa para análises de largo espetro

FÁCIL identificar as moléculas

Não é necessário fraccionar previamente a amostra

Question 8

Metabolómica

9.3. Interpretação Biológica

Answer 8

Clustering- procura de metabolitos que remetam para vias metabólicas específicas

Identificação total do metaboloma impedida por:

// díficil parar por completo a atividade metabólica da células -- metabolitos perdidos
// NÃO há um protocolo de extração ideal -- perdem-se se sempre metabolitos especialmente os mais voláteis
// moléculas têm massas moleculares + classes muito diferentes -- processo de análise e identificação díficil

Ex: estudo da resistência a antibióticos de um conjunto de isolados clínicos