3. Assembly-4. Anotação do genoma-5. Genómica Comparativa -6. Transcritómica

Question 1

3.1. Reference Guided Assembly

Question 2

De novo assembly

Answer 2

[Definition]

Reads -> Contigs -> Scaffolds (paired-end reads)

Problemas devem-se a:

1. gaps
2. falta de consenso
3. contigs mal organizados
4. regiões repetidas alinhadas como se fossem iguais

Polishing/finishing

Question 3

Depois de compilar toda a informação é provável que esta não corresponda à totalidade do genoma do organismo OU que não tenha a qualidade desejada. Quais são as principais razões para esta disparidade?

Answer 3

• Gaps (descontinuidade entre scaffolds)
• Falta de consenso (regiões de baixa qualidade e bases ambíguas)
• Erros da polimerase –> usar mais cópias
• Contigs incorretamente organizados
• Regiões repetidas no genoma que são alinhadas como se estivessem no mesmo local –> usar reads maiores

Question 4

4. Anotação do genoma

Como se determina a localização das regiões codificantes?

Answer 4

Localizar ORF’s - Open Reading Frames:

1- Procurar codões START

2. Procurar regiões reguladoras a montante da ORF
3. Tendência do uso de determinados codões (raros vs frequentes)
4. Tendência do uso de C ou G como terceira base do codão
5. Usar BLASTP para confirmar que as regiões encontradas codificam proteínas. Se sim correspondem a genes

Question 5

5. Genómica Comparativa

Answer 5

Def.

• Anotação e análise da estrutura do genoma
• Análise de SNP’s
• • Critérios para escolher SNP’s
• -Vantagens de usar reads vs contigs
• -Razões para reads não alinharem com a referência

Question 6

5. Genómica Comparativa

Que diferenças se podem obter através da anotação e análise da estrutura do genoma?

Answer 6

Usa-se o genoma de 2 espécies próximas, sendo uma delas (já anotada) a referência para anotar outra.

Neste caso, usa-se as proteínas descritas na referência para confirmar as previsões informáticas feitas para o genoma em estudo.

BLAST

• Baixa resolução
• Permite identificar grandes rearranjos

Question 7

Análise de SNPs

Answer 7

Téncica de resolução elevada que consegue detetar alterações em apenas um nucleótido

Reads (muito pequenas) são comparadas com o genoma de referência

Foco deve ser em SNP’s não silenciosos em que ocorram em seuqências codificantes

Question 8

6. Transcritómica

Answer 8

Estudo do transcritoma - conjunto de todos os RNA’s produzidos pela célula em determinadas condições

Técnicas:

• Northern Blot (marcação radioativa)
• PCR quantitativo - real time reverse transcription PCR (mRNA -> cDNA)

> > Arrays de DNA
RNA-Seq

Question 9

6. Trancritómica

Arrays de DNA

Answer 9

Def: um array ou chip de DNA é uma superfície que contêm sondas fixas (estas vão hibridar com o DNA). Dependendo da superfície utilizada podem-se chamar microarrays ou macroarrays.

Macro vs Micro

Spotted DNA Arrays

Chips de elevada densidade de oligonucleótidos

Question 10

RNA-Seq

Answer 10

1. Preparação da biblioteca
2. Sequenciação
3. Análise dos dados

< Contribuição para a anotação >

Vantagens (6)