1.-2.Técnicas de Sequenciação

Question 1

Sequenciação de Genomas

Answer 1

Técnica geral de sequenciação:

1. Cultura
2. Extração
3. Fragmentação
4. Eletroforese
5. Recolha
6. Sequenciação e assembly

Question 2

Preparar o gDNA

Answer 2

Clone by clone

Whole-genome shotgun

Question 3

Sanger sequencing

Question 4

NGS vs Sanger

Answer 4

• NGS evita passos limitantes (extração de gDNA e seleção de colónias mutantes)
• NGS + barata
• NGS tem reads menores -> processo de assembly é mais moroso e complicado
• NGS maior capacidade de erro
• NGS DNA está sempre imobilizado

NGS distingue-se por:

• PCR de emulsão
• Amplificação em fase sólida (PCR em ponte)

Question 5

Pirossequenciação Roche 545

Answer 5

Amplificação:
1. Fragmentação de DNA
2. Adição de adaptadores de seq conhecida
3. Desnaturação dos fragmentos para cadeia simples
4. Emulsão: beads c primers + DNA + dNTP + polimerase
1 fragmento DNA - 1 bead
5. PCR até que bead coberta
6. Placa com poços: 1 poço - 1 bead

Sequenciação:

1. Sucessivamente com 1 de 4 nucleótidos
2. Nucleótido incorporado -> pirofosfato
3. Pirofosfato -> ATP -> Luz (Luciferease)
4. Intensidade da luz proporcional ao número de nucleótidos

Question 6

Ion Torrent

Answer 6

Amplificação:

• Preparação da amostra + PCR = pirossequenciação
• Beads são carregadas em poços num chip semicondutor

Sequenciação:
Placa é lavada sequencialmente com cada um dos 4 nucleótidos. Cada vez que um nucleótido se liga um ião de hidrogénio é libertado -> alteração pH no poço
Esta alteração de pH é convertida numa diferença de potencial que é proporcional à quantidade de nucleótidos adicionados

Principais características?

Question 7

Illumina

Question 8

NGS de 3ª Geração (PacBio)

Answer 8

Read length: 10kb

Caract:

• Não existem adaptadores nem primers mas sim loops que permitem ter DNA circular
• Polimerase imobilizada
• Sempre que cada nucleótido é incorporado liberta-se um pulse (NÃO é por fluorescência)
• Não tem passo de amplificação pq o método é sensível o suficiente
• Não é ideal para SNP’s melhor para fazer contigs

Vantagens + Desvantagens