7. Proteómica Flashcards
Protocolo
- Definir condições de cultura (controlo vs stress) + preparar cultura de células
- Obter extratos proteicos de interesse
- Fracionar extratos proteicos /Separar proteínas
- Visualizar / detetar proteínas
- Quantificar a abundância relativa de cada proteína em cada condição
- Identificar as proteínas
Análise proteómica
- Obtenção de extratos proteicos
Tampão apropriado
Se não
ANÁLISE COMPROMETIDA!!
perda de proteínas e amostra não representativa do proteoma
Deve conter inibidores de proteases!!
Descreve o passo 3 da análise proteómica:
- Fracionar extratos proteicos/Separação de proteínas
> > 1-D - separação de acordo com o seu PM.
Baixa resolução; feita por comparação com marcadores
> > 2-D - 1º ponto isoelétrico da proteína (IEF), 2º PM (1-D)
Focagem isoelétrica (IEF) - usa um gradiente de pH imobilizado (IPG) para separar as proteínas de acordo com o seu ponto isoelétrico. Geralmente o gradiente utilizado é entre 3 e 7 mas o extremo superior tb pode ser 10
( !! há perda de proteínas com pontos isoelétricos extremos !!)
Proteómica
- Visualização/Deteção das proteínas
Deteção depende do tipo de marcação de proteínas
- Radioatividade
- SPYRO Ruby
- Nitrato de prata
- Azul de comassie
Proteómica redox (deteção do perfil de oxidação do proteoma)
Análise proteómica
- Análise quantitativa - Comparação de géis
Como se compara a abundância de proteínas?
Requer software específico
Descrever normalização
Problema principal
Proteómica
- Identificação das proteínas
Electroblotting: sequenciação e imunodeteção
Espetrometria de Massa
ETC ETC
Espetrometria de Massa (MS) para identificação de proteínas
Técncia MALDI-TOF
- Digerir proteínas (tripsina) -> péptidos
- Análise por espetrometro -> M péptido
- Peptide mass fingerprinting (PMF) - conjunto de péptidos identifica a proteína
- ID da proteína
Vantagens:
Permite identificar mods pós tradução
Resultados podem ser ambíguos
Limitações
Proteína integrais da membrana não podem ser identificadas
Limitações das técnicas baseadas 2-D
Alternativas a 2D
MudPIT
iTRAQ
ICAT
SILAC
MudPIT
Multi dimensional Protein Identification Technology
aka
Shotgun proteomics
Mesmo príncipio que separação em gel 2D MAS usando MDLC (cromatografia líquida multidimensional)
- Digestão
- Separação por MDLC (multidimensional liquid chromatography)
- Obtenção do espetro de massa (MS/MS ou MS^2)
- Comparar espetro com base de dados
- Identificar proteínas a partir dos péptidos
> > 1 amostra
ICAT
I sotopoe
C oded
A finnity
T ags
Tag= grupo reaccional (connects to the aminoacid)
+ cadeia intermédia (HEAVY / LIGHT)
+ cauda (biotina permite realizar cromatografia de afinidade)
- Amostras marcadas (light tag + heavy tag)
- Misturadas + digeridas
- Cromatografia de afinidade biotina
- MS
- MS/MS
iTRAQ
SILAC
Stable Isotope Labelling w Aminoacids in cell Culture
À cultura de células são fornecidos aa marcados com isótopos
Same as ICAT MAS permite estudar denovo sythesized proteome
Permite comparar 3 amostras
Técnicas baseadas em LC-MS vs 2D
Vantagens ^_^
. Mais rápidas
.Permitem identificam e quantificação de proteínas com pontos isoeleétricos extremos de pouca abundânica e hidrofóbicas
Desvantagens T_T
.Mais caras
.Mais complexas
