7. Análise da Interação DNA-Proteínas Flashcards
Ensaios de Interação DNA Proteína
- Imunoprecipitação de Cromatina
- Mobilidade Eletroforética
- DNA Pull-down
- Footprinting
- DNAse Hypersensitive Sites
Ensaio de Mobilidade Eletroforética
Método + sensível para o estudo das propriedades de ligação das proteínas ao DNA
Procedimento Ensaio de Mobilidade Eletroforética
- Sonda é marcada radioativamente
- Mistura complexa de proteínas ou proteína purificada reage com a sonda
- Análise da reação de ligação num gel não desnaturante de poliacrilamida (PAGE)
Sonda
Fragmento de DNA com um potencial local de ligação à proteína de interesse
Objetivo da adição de anticorpos específicos ao gel da reação
Identificar a proteína que se ligou à sonda
Adição do Ac não teve efeito:
A proteína reconhecida pelo Ac não está envolvida na formação do complexo
Ac bloqueia a formação de complexo:
A proteína que forma complexo é reconhecida pelo AC
Forma-se complexo sonda-proteína-Ac:
Há diminuição da mobilidade eletroforética em comparação com o complexo DNA-proteína (supershift)
Objetivo dos Ensaios de Competição
Avaliar a especificidade da reação de ligação DNA-proteína
Ensaio de Competição
Adição em excesso de um competidor específico não marcado juntamente com a sonda marcada
Ensaio de Imunoprecipitação de Cromatina
Usado para determinar se as proteínas estão associadas com regiões específicas do DNA em tecidos/células vivas
Procedimentos Imunoprecipitação de Cromatina
- Isolamento da Cromatina
- Indução da ligação entre proteínas e DNA
- Adição de formaldeído
- Lise das células e sonicação
- Obtenção de fragmentos de DNA ligados às proteínas
- Complexo DNA-proteína obtido é imunoprecipitado usando um Ac contra a proteína de interesse
- Ligação cross-linking entre DNA-proteína é revertida pela ação da do calor e pelo tratamento do meio com proteinase K
- A porção do DNA do complexo é depois purificada e identificada por PCR usando primers específicos que têm capacidade de se ligar ao DNA
