1. Tecnologia do DNA Recombinante Flashcards
Enzimas de Restrição
Reconhecem locais específicos e cortam em locais concretos
Tipos de Enzimas de Restrição
- Tipo I
- Tipo II
- Tipo III
Tipo II
- Só possuem atividade de restrição
- Só precisam de Mg2+ como cofator
- Cortam a ligação numa região interna do local de reconhecimento
Tipo I e III
Cortam pares de base a jusante ou a montante do local
Palindromas
Sequências de DNA que se lêem da mesma forma para a frente e para trás
Tipos de Extremidades
- Sticky
- Blunt
Extremidades Sticky
Não são cortadas em ‘‘linha reta’’
Extremidades Blunt
São cortadas em ‘‘linha reta’’
Digestão total
Maior nº de fragmentos
Mais pequenos
Digestão parcial
Menor nº de fragmentos
Maiores
Procedimento Recombinação de DNA
DNA + Vetor –> DNA Recombinante –> Replicação em células hospedeiras –> Isolamento, sequenciação e purificação do DNA
Vetores de Clonagem
- Plasmídeos
- Bacteriófagos
- Cosmídeos
- YAC
Características dos Vetores de Clonagem
- Origem de Replicação
- Sítios únicos de restrição
- Marcadores de seleção
Plasmídeos
- Clonagem de pequenos fragmentos de DNA
- Os seus genes conferem resistência a antibióticos
Região Polilinker do Plasmídeo
- Local de clonagem
- Onde se encontram as enzimas de restrição
Identificação de bactérias transformadas
- Transformação das células
- Seleção das que receberam o plasmídeo em ampicilina
- Seleção das que têm DNA recombinante com IPTG e X-Gal
Células com DNA Recombinante
Cultura de cor Amarela
Células sem DNA Recombinante
Cultura de cor Azul
Bacteriófagos
- Vírus Bacterianos Modificados
- Usados na construção de DNA genómico e cDNA
- Aceitam sequências maiores de DNA
- Propagam-se através de células bacterianas infetadas
Procedimento Bacteriófagos
- Clivagem DNA com enzimas de restrição
- Remoção da região substituinte no DNA do Fago
- Junção dos 2 fragmentos obtidos (fago + DNA estranho)
- Incorporação do DNA no fago (in vitro)
- Infeção de E. coli pelo fago e replicação
- Lise da E. coli e formação de placas fágicas
- Adsorção do DNA fágico por uma membrana de nitrocelulose
- Incubação em solução alcalina para provocar a lise
- Obtenção de cadeias simples
- Deteção do sinal com autoradiografia
Cosmídeos
- Hibridação entre plasmídeos e fagos
- Usado na construção de bibliotecas genómicas
- Entra na células por infeção fágica e é mantido como plasmídeo
Procedimento Cosmídeos
DNA fágico (sítio cos) + Plasmídeo –> Cosmídeo + DNA de interesse –> Unidades concatoméricas –> Inserção em partícula viral –> Infeção de células hospedeiras
BAC
- Cromossoma artificial bacteriano
- Cromossomas que contêm o DNA estranho + marcador de seleção e origem de replicação
YAC
- Cromossoma artificial de levedura
- Cromossomas com DNA estranho, centrómero, telómeros, ARS e marcador de seleção
Tipos de Vetores de Expressão
- Simples
- Shuttle
Vetores de Expressão Simples
Só têm capacidade de serem utilizados num tipo de células
Vetores de Expressão Shuttle
Têm capacidade de se propagarem em duas células hospedeiras diferentes
Subclonal
Fragmento de DNA transferido de um vetor para outro
Biblioteca Genómica
Gene cortado aleatoriamente ´com tamanho apropriado para o vetor e promover a sua ligação, com formação de um clone
Biblioteca de cDNA
Gene de mRNA de uma células isolado, convertido em cDNA (com transcriptase reversa) e ligado a um vetor
