1. Tecnologia do DNA Recombinante Flashcards

1
Q

Enzimas de Restrição

A

Reconhecem locais específicos e cortam em locais concretos

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Q

Tipos de Enzimas de Restrição

A
  • Tipo I
  • Tipo II
  • Tipo III
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Q

Tipo II

A
  • Só possuem atividade de restrição
  • Só precisam de Mg2+ como cofator
  • Cortam a ligação numa região interna do local de reconhecimento
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4
Q

Tipo I e III

A

Cortam pares de base a jusante ou a montante do local

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5
Q

Palindromas

A

Sequências de DNA que se lêem da mesma forma para a frente e para trás

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6
Q

Tipos de Extremidades

A
  • Sticky

- Blunt

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7
Q

Extremidades Sticky

A

Não são cortadas em ‘‘linha reta’’

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8
Q

Extremidades Blunt

A

São cortadas em ‘‘linha reta’’

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9
Q

Digestão total

A

Maior nº de fragmentos

Mais pequenos

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10
Q

Digestão parcial

A

Menor nº de fragmentos

Maiores

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11
Q

Procedimento Recombinação de DNA

A

DNA + Vetor –> DNA Recombinante –> Replicação em células hospedeiras –> Isolamento, sequenciação e purificação do DNA

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12
Q

Vetores de Clonagem

A
  • Plasmídeos
  • Bacteriófagos
  • Cosmídeos
  • YAC
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13
Q

Características dos Vetores de Clonagem

A
  • Origem de Replicação
  • Sítios únicos de restrição
  • Marcadores de seleção
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14
Q

Plasmídeos

A
  • Clonagem de pequenos fragmentos de DNA

- Os seus genes conferem resistência a antibióticos

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15
Q

Região Polilinker do Plasmídeo

A
  • Local de clonagem

- Onde se encontram as enzimas de restrição

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16
Q

Identificação de bactérias transformadas

A
  • Transformação das células
  • Seleção das que receberam o plasmídeo em ampicilina
  • Seleção das que têm DNA recombinante com IPTG e X-Gal
17
Q

Células com DNA Recombinante

A

Cultura de cor Amarela

18
Q

Células sem DNA Recombinante

A

Cultura de cor Azul

19
Q

Bacteriófagos

A
  • Vírus Bacterianos Modificados
  • Usados na construção de DNA genómico e cDNA
  • Aceitam sequências maiores de DNA
  • Propagam-se através de células bacterianas infetadas
20
Q

Procedimento Bacteriófagos

A
  • Clivagem DNA com enzimas de restrição
  • Remoção da região substituinte no DNA do Fago
  • Junção dos 2 fragmentos obtidos (fago + DNA estranho)
  • Incorporação do DNA no fago (in vitro)
  • Infeção de E. coli pelo fago e replicação
  • Lise da E. coli e formação de placas fágicas
  • Adsorção do DNA fágico por uma membrana de nitrocelulose
  • Incubação em solução alcalina para provocar a lise
  • Obtenção de cadeias simples
  • Deteção do sinal com autoradiografia
21
Q

Cosmídeos

A
  • Hibridação entre plasmídeos e fagos
  • Usado na construção de bibliotecas genómicas
  • Entra na células por infeção fágica e é mantido como plasmídeo
22
Q

Procedimento Cosmídeos

A

DNA fágico (sítio cos) + Plasmídeo –> Cosmídeo + DNA de interesse –> Unidades concatoméricas –> Inserção em partícula viral –> Infeção de células hospedeiras

23
Q

BAC

A
  • Cromossoma artificial bacteriano

- Cromossomas que contêm o DNA estranho + marcador de seleção e origem de replicação

24
Q

YAC

A
  • Cromossoma artificial de levedura

- Cromossomas com DNA estranho, centrómero, telómeros, ARS e marcador de seleção

25
Tipos de Vetores de Expressão
- Simples | - Shuttle
26
Vetores de Expressão Simples
Só têm capacidade de serem utilizados num tipo de células
27
Vetores de Expressão Shuttle
Têm capacidade de se propagarem em duas células hospedeiras diferentes
28
Subclonal
Fragmento de DNA transferido de um vetor para outro
29
Biblioteca Genómica
Gene cortado aleatoriamente ´com tamanho apropriado para o vetor e promover a sua ligação, com formação de um clone
30
Biblioteca de cDNA
Gene de mRNA de uma células isolado, convertido em cDNA (com transcriptase reversa) e ligado a um vetor