1. Tecnologia do DNA Recombinante

Question 1

Enzimas de Restrição

Answer 1

Reconhecem locais específicos e cortam em locais concretos

Question 2

Tipos de Enzimas de Restrição

Answer 2

• Tipo I
• Tipo II
• Tipo III

Question 3

Tipo II

Answer 3

• Só possuem atividade de restrição
• Só precisam de Mg2+ como cofator
• Cortam a ligação numa região interna do local de reconhecimento

Question 4

Tipo I e III

Answer 4

Cortam pares de base a jusante ou a montante do local

Question 5

Palindromas

Answer 5

Sequências de DNA que se lêem da mesma forma para a frente e para trás

Question 6

Tipos de Extremidades

Answer 6

• Sticky

- Blunt

Question 7

Extremidades Sticky

Answer 7

Não são cortadas em ‘‘linha reta’’

Question 8

Extremidades Blunt

Answer 8

São cortadas em ‘‘linha reta’’

Question 9

Digestão total

Answer 9

Maior nº de fragmentos

Mais pequenos

Question 10

Digestão parcial

Answer 10

Menor nº de fragmentos

Maiores

Question 11

Procedimento Recombinação de DNA

Answer 11

DNA + Vetor –> DNA Recombinante –> Replicação em células hospedeiras –> Isolamento, sequenciação e purificação do DNA

Question 12

Vetores de Clonagem

Answer 12

• Plasmídeos
• Bacteriófagos
• Cosmídeos
• YAC

Question 13

Características dos Vetores de Clonagem

Answer 13

• Origem de Replicação
• Sítios únicos de restrição
• Marcadores de seleção

Question 14

Plasmídeos

Answer 14

• Clonagem de pequenos fragmentos de DNA

- Os seus genes conferem resistência a antibióticos

Question 15

Região Polilinker do Plasmídeo

Answer 15

• Local de clonagem

- Onde se encontram as enzimas de restrição

Question 16

Identificação de bactérias transformadas

Answer 16

• Transformação das células
• Seleção das que receberam o plasmídeo em ampicilina
• Seleção das que têm DNA recombinante com IPTG e X-Gal

Question 17

Células com DNA Recombinante

Answer 17

Cultura de cor Amarela

Question 18

Células sem DNA Recombinante

Answer 18

Cultura de cor Azul

Question 19

Bacteriófagos

Answer 19

• Vírus Bacterianos Modificados
• Usados na construção de DNA genómico e cDNA
• Aceitam sequências maiores de DNA
• Propagam-se através de células bacterianas infetadas

Question 20

Procedimento Bacteriófagos

Answer 20

• Clivagem DNA com enzimas de restrição
• Remoção da região substituinte no DNA do Fago
• Junção dos 2 fragmentos obtidos (fago + DNA estranho)
• Incorporação do DNA no fago (in vitro)
• Infeção de E. coli pelo fago e replicação
• Lise da E. coli e formação de placas fágicas
• Adsorção do DNA fágico por uma membrana de nitrocelulose
• Incubação em solução alcalina para provocar a lise
• Obtenção de cadeias simples
• Deteção do sinal com autoradiografia

Question 21

Cosmídeos

Answer 21

• Hibridação entre plasmídeos e fagos
• Usado na construção de bibliotecas genómicas
• Entra na células por infeção fágica e é mantido como plasmídeo

Question 22

Procedimento Cosmídeos

Answer 22

DNA fágico (sítio cos) + Plasmídeo –> Cosmídeo + DNA de interesse –> Unidades concatoméricas –> Inserção em partícula viral –> Infeção de células hospedeiras

Question 23

BAC

Answer 23

• Cromossoma artificial bacteriano

- Cromossomas que contêm o DNA estranho + marcador de seleção e origem de replicação

Question 24

YAC

Answer 24

• Cromossoma artificial de levedura

- Cromossomas com DNA estranho, centrómero, telómeros, ARS e marcador de seleção

Question 25

Tipos de Vetores de Expressão

Answer 25

• Simples

- Shuttle

Question 26

Vetores de Expressão Simples

Answer 26

Só têm capacidade de serem utilizados num tipo de células

Question 27

Vetores de Expressão Shuttle

Answer 27

Têm capacidade de se propagarem em duas células hospedeiras diferentes

Question 28

Subclonal

Answer 28

Fragmento de DNA transferido de um vetor para outro

Question 29

Biblioteca Genómica

Answer 29

Gene cortado aleatoriamente ´com tamanho apropriado para o vetor e promover a sua ligação, com formação de um clone

Question 30

Biblioteca de cDNA

Answer 30

Gene de mRNA de uma células isolado, convertido em cDNA (com transcriptase reversa) e ligado a um vetor