6. Ensaios Repórter Flashcards

1
Q

Transfeção

A

Introdução de material genético exógeno nas células eucariotas recorrendo a vírus recombinantes, plasmídeos ou mRNAs

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2
Q

Métodos de Transfeção

A
  • Métodos Químicos (utilizam moléculas transportadoras)
  • Métodos Físicos (colocam os ácido nucleicos diretamente no citoplasma)
  • Métodos que recorrem a fatores virais
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3
Q

Métodos Químicos

A

Aproveitam o facto de os Ácidos Nucleicos possuirem carga negativa devido aos grupos fosfato

  • Transfeção por fosfato de cálcio ou DEAE-dextrane
  • Lipofeção
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4
Q

Métodos Físicos

A
  • Eletroporação

- Microinjeção

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5
Q

Eletroporação

A

Aplicação de impulsos elétricos para permeabilizar a membrana celular

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6
Q

Microinjeção

A

Injeção do DNA livre diretamente na célula (1 de cada vez)

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7
Q

Transfeção Estável

A

O DNA transfetado é inserido no genoma da célula hospedeira, havendo uma expressão estável da proteína e por isso a informação genética introduzida é conservada em gerações futuras

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8
Q

Tipos de promotores nos vetores

A
  • Minimos
  • Cunstitutivos
  • Específicos da células
  • Regulados
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9
Q

Gene Repórter

A

Sequência de nucleótidos que quando introduzida num sistema biológico permite fazer uma medida fenotípica da expressão do gene

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10
Q

Características de um Gene Repórter

A
  • Não apresenta expressão endógena
  • Ensaio deve ser rápido, sensível, simples, quantitativo e reprodutível
  • Facilmente medido e identificável
  • Proteína não pode ter qualquer efeito fisiológico na célula dos hospedeiros.
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11
Q

Exemplos de Genes Repórteres

A
  • GFP
  • Lucferase (Luc)
  • Galactosidase (B-Gal)
  • Cloranfenicol acetiltransferase (CAT)
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12
Q

Ensaios de Transfeção-Transativação

A

Baseia-se no uso de mutantes de deleção que nos vão permitir determinar as regiões de interesse em sequências de DNA

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13
Q

Plasmídeos dos Ensaios de Transfeção-Transativação

A
  • 1 contém a sequência de DNA intacta

- Restantes são inseridas deleções diferentes para verificar que região é indispensável

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14
Q

Procedimento Transfeção-Transativação

A
  • Técnicas de Recombinação de DNA
  • Ligação entre o vetor que possui o Gene Repórter e as várias sequências deletadas
  • Transformação de E.coli e isolar os plasmídeos de DNA
  • Transfeção de cada tipo de plasmídeo para células em cultura
  • Preparação de extratos celulares e avaliar a atividade da proteína repórter
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15
Q

Procedimento Transfeção-Transativação

A
  • Técnicas de Recombinação de DNA
  • Ligação entre o vetor que possui o Gene Repórter e as várias sequências deletadas
  • Transformação de E.coli e isolar os plasmídeos de DNA
  • Transfeção de cada tipo de plasmídeo para células em cultura
  • Preparação de extratos celulares e avaliar a atividade da proteína repórter
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16
Q

Ensaios de Co-tranfeção

A

Faz-se a transfeção de 2 ou + plasmídeos para a mesma célula em cultura

17
Q

Site Directed mutagenesis

A

Realização de vários tipos de mutações ao nível das regiões promotoras de modo a concluir se aquela sequência funciona como elemento de resposta de determinado fator e se é mesmo importante

18
Q

Ensaios de Genes Repórter permitem:

A
  • Monitorizar a ativação de uma via de sinalização
  • Estudar a resposta biológica a determinado composto
  • Analisar fenotipicamente uma sobrexpressão de um gene ou um knock-down de um gene
  • Avaliar o modo de ação de proteínas, péptidos e ligandos