6. Ensaios Repórter Flashcards
Transfeção
Introdução de material genético exógeno nas células eucariotas recorrendo a vírus recombinantes, plasmídeos ou mRNAs
Métodos de Transfeção
- Métodos Químicos (utilizam moléculas transportadoras)
- Métodos Físicos (colocam os ácido nucleicos diretamente no citoplasma)
- Métodos que recorrem a fatores virais
Métodos Químicos
Aproveitam o facto de os Ácidos Nucleicos possuirem carga negativa devido aos grupos fosfato
- Transfeção por fosfato de cálcio ou DEAE-dextrane
- Lipofeção
Métodos Físicos
- Eletroporação
- Microinjeção
Eletroporação
Aplicação de impulsos elétricos para permeabilizar a membrana celular
Microinjeção
Injeção do DNA livre diretamente na célula (1 de cada vez)
Transfeção Estável
O DNA transfetado é inserido no genoma da célula hospedeira, havendo uma expressão estável da proteína e por isso a informação genética introduzida é conservada em gerações futuras
Tipos de promotores nos vetores
- Minimos
- Cunstitutivos
- Específicos da células
- Regulados
Gene Repórter
Sequência de nucleótidos que quando introduzida num sistema biológico permite fazer uma medida fenotípica da expressão do gene
Características de um Gene Repórter
- Não apresenta expressão endógena
- Ensaio deve ser rápido, sensível, simples, quantitativo e reprodutível
- Facilmente medido e identificável
- Proteína não pode ter qualquer efeito fisiológico na célula dos hospedeiros.
Exemplos de Genes Repórteres
- GFP
- Lucferase (Luc)
- Galactosidase (B-Gal)
- Cloranfenicol acetiltransferase (CAT)
Ensaios de Transfeção-Transativação
Baseia-se no uso de mutantes de deleção que nos vão permitir determinar as regiões de interesse em sequências de DNA
Plasmídeos dos Ensaios de Transfeção-Transativação
- 1 contém a sequência de DNA intacta
- Restantes são inseridas deleções diferentes para verificar que região é indispensável
Procedimento Transfeção-Transativação
- Técnicas de Recombinação de DNA
- Ligação entre o vetor que possui o Gene Repórter e as várias sequências deletadas
- Transformação de E.coli e isolar os plasmídeos de DNA
- Transfeção de cada tipo de plasmídeo para células em cultura
- Preparação de extratos celulares e avaliar a atividade da proteína repórter
Procedimento Transfeção-Transativação
- Técnicas de Recombinação de DNA
- Ligação entre o vetor que possui o Gene Repórter e as várias sequências deletadas
- Transformação de E.coli e isolar os plasmídeos de DNA
- Transfeção de cada tipo de plasmídeo para células em cultura
- Preparação de extratos celulares e avaliar a atividade da proteína repórter