4. Métodos Experimentais de Avaliação

Question 1

Métodos Experimentais

Answer 1

• Northern blot
• Run on Transcription
• DNA micro-arrays
• PCR em tempo real (qRT-PCR)

Question 2

Northern Blot

Answer 2

• Método padrão para deteção e quantificação de mRNA
• Permite comparação da abundância relativa dos mRNAs de várias amostras
• Permite a determinação do tamanho dos transcritos e deteção dos transcritos de splicing alternativo

Question 3

Procedimento Northern Blot

Answer 3

• Extração RNA total
• Fracionamento com eletroforese em gel desnaturante
• Transferências das moleculas separadas para um suporte sólido (nitrocelulose ou nylon)
• Hibridação com sondas moleculares específicas marcadas radioativamente
• Auto-radiografia

Question 4

Normalização dos resultados

Answer 4

Usamos um controlo interno (gene cuja expressão não varia ao longo do tempo) para verificar se o aumento da intensidade do sinal corresponde ao aumento da expressão do RNA
- Dividimos o nº de vezes que o sinal aumentou pelo nº de vezes que o sinal aumentou com o controlo interno

Question 5

Exemplo de controlo interno

Answer 5

B-actina

Question 6

Run on Transcription

Answer 6

Permite determinar as taxas relativas de transcrição de diferentes genes em culturas de diferentes células

Question 7

Procedimento Run on Transcription

Answer 7

• Isolamento de núcleos (através de fracionamento celular)
• Incubação na presença de UTP [α-32 P], 10 minutos
  3- extracção dos RNAs neo-sintetisados radioactivos
• Extração das moléculas de RNA neo-sintetizadas com atividade
• Quantificação dos RNAs transcritos específicos por hibridação molecular com sondas (cDNA ou oligonucleotídicas) específicas do gene em estudo, previamente imobilizadas num suporte sólido
• Auto-radiografia, contagem da radioactividade específica e determinação das taxas de transcrição

Question 8

DNA Microarrays

Answer 8

• Permite a identificação de organismos e genes específicos através da hibridação do DNA do organismo com a sonda oligonucleotídica
• Identifica facilmente genes que codificam para a resistência a antibióticos

Question 9

Procedimento Microarrays

Answer 9

• mRNA em estudo é isolado e convertido em cDNA pela transcriptase reversa
• Os fragmentos de DNA de diferentes amostras são misturados e usados como sonda
• Cada cDNA hibrida com as sequências complementares que estão no microarray
• O Microarray é colocado num scanner para ver a intensidade da cor

Question 10

PCR

Answer 10

Usada para amplificar regiões específicas do DNA dentro de uma molécula maior

Question 11

Componentes da Reação de PCR

Answer 11

• DNA molde
• Primers
• DNA polimerase
• Nucleótidos
• Tampão da reação

Question 12

Ciclos de amplificação PCR

Answer 12

30 - 35 ciclos com 3 etapas

Question 13

Etapas dos Ciclos de amplificação PCR

Answer 13

• Desnaturação
• Hibridação
• Elongação

Question 14

RT-PCR

Answer 14

• Parte de uma amostra de RNA em vez de DNA

- Utiliza a Transcriptase reversa que forma uma molécula de cDNA a partir do RNA

Question 15

Efeito de Plateau

Answer 15

Ocorre acima dos 35 ciclos de amplificação, em que já não há aumento do produto de amplificação

Question 16

Acontecimentos do Efeito de Plateau

Answer 16

• Depleção de reagentes
• Perda de atividade da polimerase
• Reemparelhamento do produto
• Incompleta desnaturação

Question 17

Real Time PCR

Answer 17

• Permite a deteção e quantificação da sequência nucleotídica específica com a deteção do produto de PCR em tempo real
• Os produtos são detetados usando corantes fluorescentes