6. Diagnostic moléculaire Flashcards
Qu’est-ce que le site consensus d’épissage
Site entre les introns et exon
Les ilots CpG sont des endroits fréquents de mutation. Quelle est cette mutation
CG devient TG
Qu’est-ce qu’un microsatellite
Répétition d’une séquence
-Moyenne variation
Qu,est-ce qu’un SNP
Une variation dans l’ADN
-petite variation
Quel est le type le plus fréquent de mutation
Substitutions
Nomme différentes conséquences des variations sur l’ADN
- Homologue
- Faux-sens
- Non-sens
- Frameshift
Quels sont les éléments à considérer pour classifier une variation de bénin/ pathologique
- Fréquence de la mutation dans la population
- Conservation
- Impact ARNm (ex : épissage)
- Impact sur protéine
- Fonction du gène
Quelle est la différence entre une perte et gain de fonction
Perte : phénotype causé par réduction dans la quantité / activité de la protéine
Gain : phénotype causé par augmentation de la quantité / activité de la protéine
Nomme quelques mécanismes associés aux gains de fonction
- Augmentation du dosage génique (plus d’ADN codant pour cette protéine)
- Altération de l’expression de l’ARNm
- Activité accrue de la protéine
- Nouvelle fonction de la protéine
- Altération toxique à la protéine
Quelles cellules utilisent-on pour l’isolation de l’ADN
Cellules nucléées (sang : leucocyte)
Quelles sont les deux substances utilisées pour isoler un ADN
- Phénol-chlorophorme
2. Sels chaotropique
Pourquoi les sels chaotropiques sont-ils plus avantageux
Non-toxique
Automatisable
Comment fonctionne le phénol-chlorophorme
Joue sur la charge - de l’ADN
COmment fonctionne les sels chaotropique
Joue sur l’adhérence de l’ADN sur le verre et la solubilité des autres composantes
Quels sont les deux façons d’évaluer l’efficacité de l’isolation de l’ADN
- Densité optique
2. Teinture intercalantes
Comment la densité optique permet de mesurer l’efficacité de l’isolation de l’ADN
ADN : Absorbance max à 260 nm
Protéine : 280 nm
Ratio 260/280 estime pureté
Comment la teinture intercalante permet de mesurer l’efficacité de l’isolation de l’ADN
Teinture se fixe à ADN
Estimation de la quantité et taille de l’ADN
Décrit l’hybridation de façon générale
- Construction séquence de nucléotide complémentaire à une portion de l’ADN
- Sonde est marquée (fluorescence, radioactivité)
- Détection signal indique présence de la séquence complémentaire
Quel est le but de l’électrophorèse capillaire
Séparer les molécules d’ADN selon leur taille en les faisant migrer à travers un gel
Qu’est-ce que le buvardage southern (nomme les étapes)
- Digestion de l’ADN génomique
- Électrophorèse capillaire
- Transfer sur membrane
- Hybridation
- Détection par autoradiographie
Quel est le but du buvardage southern
Quantifier les grandes expansions (mutations dynamiques)
Quels sont les composantes de la réaction de PCR
- ADN patient
- Amorces
- Polymérase
- Nucléotides
- Tampons
- Autre additifs si nécessaire
Quel est le but de la PCR
Doubler l’ADN à chaque cycle
Quel est le but de la PCR migration
Détection insertion / délétions récurrente Analyse d'identité génétique -Instabilité microsatellites -Contamination foeto-maternelle -Judiciaire
Comment fonction le PCR migration
Électrophorèse capillaire des produits de PCR
Détection du signal
Quelles sont les applications du PCR-digestion
Détection mutations ponctuelles récurrentes
Trouver un site de restriction créé ou aboli par la mutation que l’on recherche
Comment fonctionne l’allele specific primer extension
- Amplification PCR
- Jeux d’amorces marquées fluorescence dont certaines ont mismatch 3’
- Extension si match 3’
- Détection
Quel est le but du séquençage Sanger
Détecter la séquence d’ADN à un nucléotide près
Quels sont les étapes du séquençage Sanger
- Amplification PCR
- Dénaturation
- Réamplification avec mélange de nucléotides et nucléosides marqués par fluorescence
Quelle est la différence entre les dNTP et ddNTP
ddNTP n’ont pas de -OH au C3 du ribose
Empêche la liaison du prochain dNTP
Quels sont les applications possibles du séquençage Sanger
- Gènes avec grand nombre de mutations
- Méthode de choix pour substitution
- Bonne méthode pour petites insertions / délétion
- Ne détecte pas les grandes anormalies de dosage
Quelles sont les possibilités de PCR temps réel
- Discrimination allélique
2. Quantiification (relative / absolue)
Décrit la méthode de l’essai TaqMan (PCR temps réel)
- Sonde composé d’un rapporteur et inhibiteur
- Sonde se lie à l’ADN et amorce
- Taq libère rapporteur ce qui génère fluorescence
Quel est le but du PCR temps réel pour discrimination allélique
Quantifier nombre d’ADN contenant séquence
Quels sont les étapes du PCR temps réel quantitative
- Fixer un seuil arbitraire (unités relatives de fluorescence)
- Seuil est le même pour tous les patients
- Quantifie nombre d’ADN basé sur le nombre de cycle à atteindre le seuil
Le MLPA est une méthode pour la recherche de quoi
Délétions / duplications
Décrit brièvement le MLPA
- Sonde en 2 sous-unités qui s’hybride côte-à-côte sur l’ADN du patient
- Ligase scelle sous-unités
- Amplification PCR
- Électrophorèse capillaire
Quelle est l’utilité des adaptateurs de séquençage
“code-barre” moléculaire
-ex : pour identifier les différents patients
Quels sont les deux façons d’amplification en parallèle
- PCR-émulsion
2. PCR-cluster
Quel est le but du séuençage de nouvelle génération (SNG)
Isoler les séquences d’ADN visé par le test afin de les amplifier sélectivement
Quels sont les applications SNG
- Identification exome
2. Analyse ADN foetal circulant dans sang de mère
