4th Chapter

Question 1

Τι οδήγησε στην ανάπτυξη της τεχνολογίας τουανασυνδυασμένου DNA;

Answer 1

1) Η απομόνωση των περιοριστικών ενδονουκλεασών (και γενικότερα η χρήση πολυάριθμων ενζύμων)
2) Η απομόνωση φορέων που μεταφέρουν το DNA από κύτταρο σε κύτταρο

Question 2

Τι είναι η τεχνολογία του ανασυνδυασμένου DNA;

Answer 2

Το σύνολο των τεχνικών που οδηγούν στην in vitro μεταφορά γενητικού υλικού από τον ένα οργανισμό στον άλλο με τη βοήθεια ενζύμων

Question 3

Τι δυνατότητες έδωσε στους ερευνητές η ανάπτυξη της τεχνολογίας του ανασυνδυασμένου DNA; Ποιες οι εφαρμογές της;

Answer 3

ΔΥΝΑΤΟΤΗΤΕΣ
Να ερευνούν
να επεμβαίνουν
να τροποποιούν το γενετικό υλικό των οργανισμών
ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ
παραγωγή προιόντων(πρωτείνες)
δημιουργία οργανισμών με βελτιωμένες ιδιότητες

Question 4

Τι είναι η γενετική μηχανική και ποιοι οι στόχοι που επιτεύχηκαν με τη βοήθεια της;

Answer 4

Ορισμός: Σύνολο των τεχνικών με τις οποίες ο άνθρωπος επεμβαίνει στι γενετικό υλικό.
Στόχοι: Κατανανόηση των μυστηρίων της ζωής και της εξέλιξης
Βελτίωση υγείας και τρόπου διαβίωσης

Question 5

Τι είναι οι περιοριστικές ενδονουκλεάσες (ΠΕ) ;

Answer 5

Είναι ένζυμα που παράγονται από βακτήρια.
Ο ρόλος τους είναι να προστατεύουν το βακτήριο από εισβολή ξένου DNA.
Έχουν την ικανότητα να αναγνωρίζουν και να κόβουν ειδικές αλληλουχίες 4-8 ζ.β στο δίκλωνο DNA.

Question 6

Τι είναι το ανασυνδυασμένο DNA;

Answer 6

Τεχνητό μόριο DNA που περιέχει γονίδια ή τμήματα DNA από δύο ή περισσότερους οργανισμούς

Question 7

Σε ποια κύτταρα μπορεί να εισάγεται το ανασυνδυασμένο DNA και ποιο το αποτέλεσμα;

Answer 7

Μπορεί να εισάγεται σε βακτήρια ή σε ευκαρυωτικά κύτταρα.
Τα γενετικά τροποποιημένα αυτά κύτταρα είναι ικανά να ζουν και να αναπαράγονται μεταφέροντας στους απογόνους τους τις καινούριες ιδιότητες.

Question 8

Τι είναι κλώνος;

Answer 8

Είναι ένα σύνολο πανομοιότυπων μορίων, κυττάρων ή οργανισμών

Question 9

Τι είναι η κλωνοποίηση;

Answer 9

Η διαδικασία κατασκευής μεγάλου αριθμού κλώνων

Question 10

Τι είναι ο μετασχηματισμός;

Answer 10

Είναι η εισαγωγή DNA (ανασυνυασμένου ή μη) σε βακτηριακό κύτταρο ξενιστή

Question 11

Τι είναι ο φορέας κλωνοποίησης;

Answer 11

Είναι ένα μόριο DNA (πλασμίδιο ή DNA φάγων), στο οποίο ενσωματώνεταιτμήμα DNA του οργανισμού δότη. Οι φορείς κλωνοποίησης μπορούν να αυτοδιπλασιάζονται ανεξάρτητα μέσα στο κύτταρο ξενιστή.

Question 12

Πλασμίδια ως φορείς κλωνοποίησης;

Answer 12

1) Έχουν θέσεις αναγνώρισης για ΠΕ
2) Ευκολία μετασχηματισμού
3) Ικανότητα ανεξάρτητου αυτοδιπλαδιασμού
4) Γονίδια ανθεκτικότητας σε αντιβιοτικά
5) ενσωματώνουν μικρότερα τμήματα DNA από βακτηριοφάγο λ

Question 13

Ποια είναι τα βασικά στάδια της διαδικασίας κλωνοποίησης;

Answer 13

1) Κατασκευή ανασυνδυασμένου DNA
2) Μεταφορά ανασυνδυασμένου DNA σε κύτταρο ξενιστή μετασχηματισμός)
3) Επιλογή και απομόνωση κυττάρων ξενιστών
4) Επιλογή ενός βακτηριακού κλώνου που περιέχει το επιθυμιτό τμήμα DNA

Question 14

Πώς πραγματοποιείται η μεταφορά του ανασυνδυασμένου DNA (1) ;

Answer 14

Το ολικό DNA ενός οργανισμού απομονώνεται, κόβεται με ένζυμα (ΠΕ) και ενώνεται με φορέα κλωνοποίησης. Έτσι δημιουργείται ανασυνδυασμένο μόριο DNA

Question 15

Πώς γίνεται η επιλογή και απομόνωση κυττάτων ξενιστών;

Answer 15

Καλλιέργεια σε θρεπτικό υλικό που να περιέχει αντιβιοτικό. Μετασχηματισμένα(εχουν πλασμίδια) βακτήρια επιβιώνουν και σχηματίζουν αποικίες. Μη μετασχηματισμλενα: δεν επιβιώνουν

Question 16

Πώς γίνεται η επιλογή βακτηριακού κλώνου που περιέχει το επιθιμητό τμήμα DNA;

Answer 16

Με ειδικά μόρια ανιχνευτές

Question 17

Ποιος ο ρόλος της DNA δεσμάσης στην δημιουργία ανασυνδυασμένου DNA;

Answer 17

Μετά την πέψη γονιδιώματος και πλασμιδίου με ίδια ΠΕ, δημιουργούνται μονόκλωνα άκρα συμπληρωματικά μεταξύ τους. Όταν αναμειχθούν μεταξύ τους, τα άκρα τους σχηματίζουν δεσμούς υδρογόνου και τελικά συνδέονται με 3-5 φ.δ χάρη στην DNA δεσμάση

Question 18

Τι είναι η γονιδιωματική βιβλιοθήκη;

Answer 18

Είναι το σύνολο των βακτηριακών κλώνων που περιέχουν το συνολικό DNA ενός οργανισμού

Question 19

Ποια είναι τα χαρακτηριστικά μιας γονιδιωματικής βιβλιοθήκης;

Answer 19

1) Περιέχει όλο το DNA του οργανισμού δότη (εσώνια, εξώνια, υποκινητές, τμήματα που δεν είναι γονίδια…)
2) Περιέχει το DNA σπασμένο σε πολλά τμήματα, καθένα σε πολλά αντίγραφα(κλώνους)

Question 20

Τι είναι η cDNA βιβλιοθήκη;

Answer 20

Είναι το σύνολο των βακτηριακών κλώνων που περιέχει αντίγραφα των mRNA όλων των γονιδίων που εκφράζονται σε έναν συγκεκριμένο κυτταρικό τύπο. Άρα έχει μόνο εξώνια!

Question 21

Γιατί είναι αναγκαία η δημιουργία cDNA βιβλιοθήκης;

Answer 21

Σε ευκαρυωτικπύς οργανισμούς, ορισμένα γονίδια εκφράζονται σε ορισμένους μονάχα κυτταρικούς τύπους. Αν θέλουμε να κλωνοποιήσουμε μόνο τις κωδικοποιούσες περιοχές αυτών (εξώνια) , κατασκευάζουμε cDNA βιβλιοθήκη.

Question 22

Στάδια κατασκευής cDNA βιβλιοθήκης

Answer 22

1) Απομόνωση συνολικού ώριμου mRNA από τα κύτταρα που εκφράζουν τα συγκεκριμένα γονίδια
2) Σύνθεση συμπληρωματικής αλυσίδας DNA (cDNA) με καλούπι κάθε μόριο mRNA. Άρα παραγωγή υβριδικών μορίων mRNA-cDNA
3) Διάσπαση mRNA με κατάλληλες χημικές ουσίες ή θέρμανση
4) cDNA χρησιμοποιείται ως καλούπι για σύνθεση συμπληρωματικής αλυσίδας DNA. Άρα δημιουργία δίκλωνου DNA
5) Εισαγωγή δίκλωνων DNA σε φορείς κλωνοποίησης

Question 23

Ποια ένζυμα είναι απαραίτητα για την κατασκευή cDNA βιβλιοθήκης; (4)

Answer 23

1) Αντίστροφη μεταγραφάση (ρετροϊοί)
2) DNA πολυμεράση(δίκλωνο DNA)
3) ΠΕ που τέμνει το πλασμίδιο
4) DNA δεσμάση(συνδέει πλασμίδιο με DNA)

Question 24

Ποια είναι τα χαρακτηριστικά-πλεονεκτήματα της cDNA βιβλιοθήκης;

Answer 24

1) Περιέχει τις αλληλουχίες των γονιδίων που μεταφράζονται σε αμινοξέα, δλδ τα εξώνια
2) Είναι χρήσιμη για μελέτη γονιδίων που εκφράζονται σε έναν κυτταρικό τύπο του οργανισμού. Δίνει την δυνατότητα παραγωγής πρωτεϊνών από βακτήρια(καθολικότητα γενετικού κώδικα)

Question 25

Που βασίζεται η επιλογή ενός βακτηριακού κλώνου με το επιθυμητό τμήμα ανασυνδυασμένου DNA; Ποια τα βήματα επιλογής;

Answer 25

Βασίζεται σε: 1) Αποδιάταξη και υβριδοποίηση
2)Χρήση ανιχνευτών
Βήματα: 1)Αποδιάταξη DNA όλων των βακτηριακών κλώνων
2)Προσθήκη ανιχνευτή
3)Υβριδοποίηση ανιχνευτή με το συμπληρωματικό μονόκλωνο DNA που προκύπτει από αποδιάταξη

Question 26

Τι είναι η αποδιάταξη και πώς επιτυγχάνεται;

Answer 26

Είνια ο διαχωρισμός των δύο συμπληρωματικών αλυσίδων ενός δίκλωνου μορίου DNA. Γίνεται με την επίδραση χημικών ουσιών και με αύξηση της θερμοκρασίας ώστε να διασπαστούον οι δεσμοί υδρογόνου που συγκραρούν τις αλυσίδες

Question 27

Τι είναι η υβριδοποίηση; Πού στηρίζεται και πού χρησιμεύει;

Answer 27

Είναι η επανασύνδεση κάτω από κατάλληλες συνθήκες μονόκλωνων, συμπληρωματικών και αντιπαράλληλων αλυσίδων DNA-DNA ή DNA- RNA
Στηρίζεται στην συμπληρωματικότητα των βάσεων
Χρησιμοποιείται στον εντοπισμό αλληλουχίας DNA με χρήση ανιχνευτή

Question 28

Τι είναι ο ανιχνευτής και που χρησιμεύει;

Answer 28

Είναι μονόκλωνα ιχνηθετημένα μόρια DNA ή RNA που κατασκευάζονται in vitro. Περιέχουν αλληλουχίες συμπληρωματικές και αντιπαράλληλες προς το τμήμα DNA που επιθυμούμε να κλωνοποιήσουμε. Άρα χρησιμεύει στον εντοπισμό κλώνων σε μία cDNA ή γονιδιωματική βιβλιοθήκη

Question 29

PCR (αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης): τι είναι, ποιο ένζυμο χρησιμοποιεί και ποιες οι εφαρμογές της;

Answer 29

Είναι τεχνική που μας επιτρέπει να πολλαπλασιάσουμε επιλεκτικά, εκατομμύρια φορές μία συγκεκριμένη αλληλουχία DNA, χωρίς τη μεσολάβηση κυττάρου(in vitro). Χρησιμοποιεί την DNA πολυμεράση. Χρησιμοποιείται για την μελέτη γονιδίων και την παραγωγή πρωτεϊνών. Βρίσκει εφαρογές στην Ιατρική (διάγνωση ασθενειών πχ AIDS), την Εγκληματολογία και την Παλαιοντολογία (μελέτη απολιθωμάτων)

Question 30

Ποιες οι μέθοδοι κλωνοποίησης;

Answer 30

1)Γονιδιωματική βιβλιοθήκη
2)cDNA βιβλιοθήκη
3)PCR
(1,2 χρήση φορέων κλωνοποίσησης)

Question 31

Ποια τα πλεονεκτήματα της PCR και ποιες οι προϋποθέσεις χρήσης της;

Answer 31

Πλεονεκτήματα: λιγότερο χρονοβόρα και επίπονη από άλλες μεθόδους κλωνοποίησης
Προϋπόθεση: Γνώση αλληλουχία βάσεων του τμήματος, για σύμθεση πρωταρχικών τμημάτων που θα επιμηκύνει η DNA πολυμεράση

Question 32

Ποιες οι προϋποθέσεις συμβατότητας των μονόκλωνων άκρων κατά τη δημιουργία ανασυνδυασμένου DNA;

Answer 32

1) Συμπληρωματικότητα

2) Αντιπαραλληλία (Οι ΠΕ που χρησιμοποιήθηκαν να κόβουν με τον ίδιο προσανατολισμό )

Question 33

Τι είναι ο μετασχηματισμός;

Answer 33

Είναι η εισαγωγή DNA σε βακτηριακό κύτταρο ξενιστή