4th Chapter Flashcards
Τι οδήγησε στην ανάπτυξη της τεχνολογίας τουανασυνδυασμένου DNA;
1) Η απομόνωση των περιοριστικών ενδονουκλεασών (και γενικότερα η χρήση πολυάριθμων ενζύμων)
2) Η απομόνωση φορέων που μεταφέρουν το DNA από κύτταρο σε κύτταρο
Τι είναι η τεχνολογία του ανασυνδυασμένου DNA;
Το σύνολο των τεχνικών που οδηγούν στην in vitro μεταφορά γενητικού υλικού από τον ένα οργανισμό στον άλλο με τη βοήθεια ενζύμων
Τι δυνατότητες έδωσε στους ερευνητές η ανάπτυξη της τεχνολογίας του ανασυνδυασμένου DNA; Ποιες οι εφαρμογές της;
ΔΥΝΑΤΟΤΗΤΕΣ
Να ερευνούν
να επεμβαίνουν
να τροποποιούν το γενετικό υλικό των οργανισμών
ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ
παραγωγή προιόντων(πρωτείνες)
δημιουργία οργανισμών με βελτιωμένες ιδιότητες
Τι είναι η γενετική μηχανική και ποιοι οι στόχοι που επιτεύχηκαν με τη βοήθεια της;
Ορισμός: Σύνολο των τεχνικών με τις οποίες ο άνθρωπος επεμβαίνει στι γενετικό υλικό.
Στόχοι: Κατανανόηση των μυστηρίων της ζωής και της εξέλιξης
Βελτίωση υγείας και τρόπου διαβίωσης
Τι είναι οι περιοριστικές ενδονουκλεάσες (ΠΕ) ;
Είναι ένζυμα που παράγονται από βακτήρια.
Ο ρόλος τους είναι να προστατεύουν το βακτήριο από εισβολή ξένου DNA.
Έχουν την ικανότητα να αναγνωρίζουν και να κόβουν ειδικές αλληλουχίες 4-8 ζ.β στο δίκλωνο DNA.
Τι είναι το ανασυνδυασμένο DNA;
Τεχνητό μόριο DNA που περιέχει γονίδια ή τμήματα DNA από δύο ή περισσότερους οργανισμούς
Σε ποια κύτταρα μπορεί να εισάγεται το ανασυνδυασμένο DNA και ποιο το αποτέλεσμα;
Μπορεί να εισάγεται σε βακτήρια ή σε ευκαρυωτικά κύτταρα.
Τα γενετικά τροποποιημένα αυτά κύτταρα είναι ικανά να ζουν και να αναπαράγονται μεταφέροντας στους απογόνους τους τις καινούριες ιδιότητες.
Τι είναι κλώνος;
Είναι ένα σύνολο πανομοιότυπων μορίων, κυττάρων ή οργανισμών
Τι είναι η κλωνοποίηση;
Η διαδικασία κατασκευής μεγάλου αριθμού κλώνων
Τι είναι ο μετασχηματισμός;
Είναι η εισαγωγή DNA (ανασυνυασμένου ή μη) σε βακτηριακό κύτταρο ξενιστή
Τι είναι ο φορέας κλωνοποίησης;
Είναι ένα μόριο DNA (πλασμίδιο ή DNA φάγων), στο οποίο ενσωματώνεταιτμήμα DNA του οργανισμού δότη. Οι φορείς κλωνοποίησης μπορούν να αυτοδιπλασιάζονται ανεξάρτητα μέσα στο κύτταρο ξενιστή.
Πλασμίδια ως φορείς κλωνοποίησης;
1) Έχουν θέσεις αναγνώρισης για ΠΕ
2) Ευκολία μετασχηματισμού
3) Ικανότητα ανεξάρτητου αυτοδιπλαδιασμού
4) Γονίδια ανθεκτικότητας σε αντιβιοτικά
5) ενσωματώνουν μικρότερα τμήματα DNA από βακτηριοφάγο λ
Ποια είναι τα βασικά στάδια της διαδικασίας κλωνοποίησης;
1) Κατασκευή ανασυνδυασμένου DNA
2) Μεταφορά ανασυνδυασμένου DNA σε κύτταρο ξενιστή μετασχηματισμός)
3) Επιλογή και απομόνωση κυττάρων ξενιστών
4) Επιλογή ενός βακτηριακού κλώνου που περιέχει το επιθυμιτό τμήμα DNA
Πώς πραγματοποιείται η μεταφορά του ανασυνδυασμένου DNA (1) ;
Το ολικό DNA ενός οργανισμού απομονώνεται, κόβεται με ένζυμα (ΠΕ) και ενώνεται με φορέα κλωνοποίησης. Έτσι δημιουργείται ανασυνδυασμένο μόριο DNA
Πώς γίνεται η επιλογή και απομόνωση κυττάτων ξενιστών;
Καλλιέργεια σε θρεπτικό υλικό που να περιέχει αντιβιοτικό. Μετασχηματισμένα(εχουν πλασμίδια) βακτήρια επιβιώνουν και σχηματίζουν αποικίες. Μη μετασχηματισμλενα: δεν επιβιώνουν
Πώς γίνεται η επιλογή βακτηριακού κλώνου που περιέχει το επιθιμητό τμήμα DNA;
Με ειδικά μόρια ανιχνευτές
Ποιος ο ρόλος της DNA δεσμάσης στην δημιουργία ανασυνδυασμένου DNA;
Μετά την πέψη γονιδιώματος και πλασμιδίου με ίδια ΠΕ, δημιουργούνται μονόκλωνα άκρα συμπληρωματικά μεταξύ τους. Όταν αναμειχθούν μεταξύ τους, τα άκρα τους σχηματίζουν δεσμούς υδρογόνου και τελικά συνδέονται με 3-5 φ.δ χάρη στην DNA δεσμάση
Τι είναι η γονιδιωματική βιβλιοθήκη;
Είναι το σύνολο των βακτηριακών κλώνων που περιέχουν το συνολικό DNA ενός οργανισμού
Ποια είναι τα χαρακτηριστικά μιας γονιδιωματικής βιβλιοθήκης;
1) Περιέχει όλο το DNA του οργανισμού δότη (εσώνια, εξώνια, υποκινητές, τμήματα που δεν είναι γονίδια…)
2) Περιέχει το DNA σπασμένο σε πολλά τμήματα, καθένα σε πολλά αντίγραφα(κλώνους)
Τι είναι η cDNA βιβλιοθήκη;
Είναι το σύνολο των βακτηριακών κλώνων που περιέχει αντίγραφα των mRNA όλων των γονιδίων που εκφράζονται σε έναν συγκεκριμένο κυτταρικό τύπο. Άρα έχει μόνο εξώνια!
Γιατί είναι αναγκαία η δημιουργία cDNA βιβλιοθήκης;
Σε ευκαρυωτικπύς οργανισμούς, ορισμένα γονίδια εκφράζονται σε ορισμένους μονάχα κυτταρικούς τύπους. Αν θέλουμε να κλωνοποιήσουμε μόνο τις κωδικοποιούσες περιοχές αυτών (εξώνια) , κατασκευάζουμε cDNA βιβλιοθήκη.
Στάδια κατασκευής cDNA βιβλιοθήκης
1) Απομόνωση συνολικού ώριμου mRNA από τα κύτταρα που εκφράζουν τα συγκεκριμένα γονίδια
2) Σύνθεση συμπληρωματικής αλυσίδας DNA (cDNA) με καλούπι κάθε μόριο mRNA. Άρα παραγωγή υβριδικών μορίων mRNA-cDNA
3) Διάσπαση mRNA με κατάλληλες χημικές ουσίες ή θέρμανση
4) cDNA χρησιμοποιείται ως καλούπι για σύνθεση συμπληρωματικής αλυσίδας DNA. Άρα δημιουργία δίκλωνου DNA
5) Εισαγωγή δίκλωνων DNA σε φορείς κλωνοποίησης
Ποια ένζυμα είναι απαραίτητα για την κατασκευή cDNA βιβλιοθήκης; (4)
1) Αντίστροφη μεταγραφάση (ρετροϊοί)
2) DNA πολυμεράση(δίκλωνο DNA)
3) ΠΕ που τέμνει το πλασμίδιο
4) DNA δεσμάση(συνδέει πλασμίδιο με DNA)
Ποια είναι τα χαρακτηριστικά-πλεονεκτήματα της cDNA βιβλιοθήκης;
1) Περιέχει τις αλληλουχίες των γονιδίων που μεταφράζονται σε αμινοξέα, δλδ τα εξώνια
2) Είναι χρήσιμη για μελέτη γονιδίων που εκφράζονται σε έναν κυτταρικό τύπο του οργανισμού. Δίνει την δυνατότητα παραγωγής πρωτεϊνών από βακτήρια(καθολικότητα γενετικού κώδικα)
Που βασίζεται η επιλογή ενός βακτηριακού κλώνου με το επιθυμητό τμήμα ανασυνδυασμένου DNA; Ποια τα βήματα επιλογής;
Βασίζεται σε: 1) Αποδιάταξη και υβριδοποίηση
2)Χρήση ανιχνευτών
Βήματα: 1)Αποδιάταξη DNA όλων των βακτηριακών κλώνων
2)Προσθήκη ανιχνευτή
3)Υβριδοποίηση ανιχνευτή με το συμπληρωματικό μονόκλωνο DNA που προκύπτει από αποδιάταξη
Τι είναι η αποδιάταξη και πώς επιτυγχάνεται;
Είνια ο διαχωρισμός των δύο συμπληρωματικών αλυσίδων ενός δίκλωνου μορίου DNA. Γίνεται με την επίδραση χημικών ουσιών και με αύξηση της θερμοκρασίας ώστε να διασπαστούον οι δεσμοί υδρογόνου που συγκραρούν τις αλυσίδες
Τι είναι η υβριδοποίηση; Πού στηρίζεται και πού χρησιμεύει;
Είναι η επανασύνδεση κάτω από κατάλληλες συνθήκες μονόκλωνων, συμπληρωματικών και αντιπαράλληλων αλυσίδων DNA-DNA ή DNA- RNA
Στηρίζεται στην συμπληρωματικότητα των βάσεων
Χρησιμοποιείται στον εντοπισμό αλληλουχίας DNA με χρήση ανιχνευτή
Τι είναι ο ανιχνευτής και που χρησιμεύει;
Είναι μονόκλωνα ιχνηθετημένα μόρια DNA ή RNA που κατασκευάζονται in vitro. Περιέχουν αλληλουχίες συμπληρωματικές και αντιπαράλληλες προς το τμήμα DNA που επιθυμούμε να κλωνοποιήσουμε. Άρα χρησιμεύει στον εντοπισμό κλώνων σε μία cDNA ή γονιδιωματική βιβλιοθήκη
PCR (αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης): τι είναι, ποιο ένζυμο χρησιμοποιεί και ποιες οι εφαρμογές της;
Είναι τεχνική που μας επιτρέπει να πολλαπλασιάσουμε επιλεκτικά, εκατομμύρια φορές μία συγκεκριμένη αλληλουχία DNA, χωρίς τη μεσολάβηση κυττάρου(in vitro). Χρησιμοποιεί την DNA πολυμεράση. Χρησιμοποιείται για την μελέτη γονιδίων και την παραγωγή πρωτεϊνών. Βρίσκει εφαρογές στην Ιατρική (διάγνωση ασθενειών πχ AIDS), την Εγκληματολογία και την Παλαιοντολογία (μελέτη απολιθωμάτων)
Ποιες οι μέθοδοι κλωνοποίησης;
1)Γονιδιωματική βιβλιοθήκη
2)cDNA βιβλιοθήκη
3)PCR
(1,2 χρήση φορέων κλωνοποίσησης)
Ποια τα πλεονεκτήματα της PCR και ποιες οι προϋποθέσεις χρήσης της;
Πλεονεκτήματα: λιγότερο χρονοβόρα και επίπονη από άλλες μεθόδους κλωνοποίησης
Προϋπόθεση: Γνώση αλληλουχία βάσεων του τμήματος, για σύμθεση πρωταρχικών τμημάτων που θα επιμηκύνει η DNA πολυμεράση
Ποιες οι προϋποθέσεις συμβατότητας των μονόκλωνων άκρων κατά τη δημιουργία ανασυνδυασμένου DNA;
1) Συμπληρωματικότητα
2) Αντιπαραλληλία (Οι ΠΕ που χρησιμοποιήθηκαν να κόβουν με τον ίδιο προσανατολισμό )
Τι είναι ο μετασχηματισμός;
Είναι η εισαγωγή DNA σε βακτηριακό κύτταρο ξενιστή
