4 - Clonage: technologie de l'ADN recombinant

Question 1

Quel élément est nécessaire pour amplifier un vecteur sans insert?

Answer 1

Une souche résistante au gène toxique.

Question 2

Quels composés du vecteur bloque la traduction des gènes? (2)

Answer 2

Le peptide ou ARNt.

Question 3

Quels sont les choix possibles pour la lyse membranaire de la cellule? (4)

Answer 3

1) Mécanique;
2) Détergent (SDS);
3) Lysozyme;
4) Lyse alcaline.

Question 4

Quels sont les choix possibles pour la séparation de l’ADN plasmidique des protéines et de l’ADN chromosomal? (3)

Answer 4

1) Neutralisation pH (ségrégationpar conformation);
2) Extraction au phénol, précipitation à l’éthanol;
3) Méthodes utilisant des billes de silice.

Question 5

Quels sont des exemples de gènes d’intérêt?

Answer 5

• Enzyme de restriction;
• ADN ligase;
• Gène synthétique;
• Gibson assembly;
• Golden Gate assembly;
• Clonage de Gateway;
• Sequence and ligation independent cloning.

Question 6

Brièvement, quel est le processus d’insertion d’un gène d’intérêt?

Answer 6

1) Le gène d’intérêt est sélectionné sur son plasmide et amplifié (via PCR);
2) Le gène d’intérêt est digéré (EcoRI et NotI sont rapetissés);
3) Le gène d’intérêt est ajouté au vecteur, auquel une digestion a été entreprise dans le but « d’ouvrir » une partie.
4) Le gène d’intérêt est ajouté au vecteur.

Question 7

Vrai ou faux? La purification de l’ADN n’est pas nécessaire lors d’une transformation génomique.

Answer 7

Faux, il faut absolument purifier l’ADN.

Question 8

Quel est le nombre de nucléotides nécessaires sur EcoRI et NotI pour faire la transformation?

Answer 8

20 à 30 nucléotides.

Question 9

Selon le code de lecture, est-ce possible de lire un codon stop?

Answer 9

Oui, c’est possible de lire un codon stop. Si le cadre de lecture est déplacé d’un nucléotide, il est possible que les codons diffèrent.

Question 10

Qu’est-ce que la méthode d’assemblage Golden Gate?

Answer 10

Cette méthode d’assemblage utilise des endonucléases de type II qui coupent à l’extérieur de la séquence de reconnaissance.

Question 11

Qu’est-ce que le produit finale NE contient PAS? (2)

Answer 11

1) Pas de sites de restriction;
2) Pas de cicatrices de clonages.

Question 12

Brièvement, quel est le processus de l’assemblage Golden Gate?

Answer 12

1) Endonucléase coupe vecteur et gène d’intérêt séparément, les deux au bout cohésif;
2) L’ajout se fait avec une ligase, sans la présence de Bsal.

Question 13

Qu’est-ce que le processus de ligation independent cloning (LIC)?

Answer 13

Ce processus créé de longues extrémités cohésives suffisamment stables pour être transformées sans ligature.

Question 14

Qu’est-ce que cela veut dire lorsqu’un extrémité est transformée sans ligature?

Answer 14

Cela veut dire que les coupures sont fixées à l’intérieur de l’E.coli.

Question 15

Quels sont les éléments nécessaires pour la LIC? (3)

Answer 15

1) ADN polymerase T4 (activité polymérase et exonucléase);
2) Séquence spécifique (pour amplification par PCR);
3) Vecteur préparé.

Question 16

Vrai ou faux? Bsal coupe l’ADN sur le site de reconnaissance.

Answer 16

Faux, Bsal coupe en dehors de la séquence de reconnaissance.

Question 17

Brièvement, quel est le processus de LIC?

Answer 17

1) Bsal coupe le plasmide avant la séquence de reconnaissance;
2) L’exonucléase coupe le plasmide et l’insert (présence de dNTP);
3) Jonction des deux séquences (14 paires de bases).

Question 18

Qu’est-ce qu’un RBS?

Answer 18

Ribosome binding site.

Question 19

Qu’est-ce que la TEV protéase? Quel est son mode d’action?

Answer 19

La TEV protéase est une enzyme qui coupe un segment protéique lorsqu’elle reconnait la séquence suivante : E-N-L-Y-F-Q (Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln). Elle coupe après Gln.

Question 20

Qu’est-ce que le processus de sequence and ligation independent cloning (SLIC)?

Answer 20

Ce processus utilise l’activité polymérase et exonucléase de l’ADN polymérase T4.

Question 21

Vrai ou faux? L’action de la T4 peut être arrêtée par l’ajout d’un seul dNTP.

Answer 21

Vrai.

Question 22

Vrai ou faux? Il est nécessaire d’avoir des séquences spécifiques pour SLIC.

Answer 22

Faux. Les séquences ne nécessitent pas d’être spécifiques.

Question 23

Brièvement, quel est le processus de SLIC?

Answer 23

1) Le produit PCR (gène d’intérêt) présente une séquence identique au vecteur;
2) La T4 polymerase agit vers 3’ de façon exo;
3) La T4 polymerase avec un dNTP agit sur les deux segments, ce qui les joint ensemble (overlap de 25 bases);
4) Les lacunes seront réparées dans E.coli.

Question 24

Qu’est-ce que le processus du Gibson Assembly?

Answer 24

Ce processus est indépendant des enzymes de restriction et des sites de restriction (comme SLIC/LIC). Son but est de produire des régions complémentaires entre l’insert et le vecteur par PCR.

Question 25

Quelles enzymes sont simultanément utilisées dans le Gibson Assembly? (3)

Answer 25

Ligase, exonucléase et polymérase.

Question 26

Brièvement, quel est le processus du Gibson Assembly?

Answer 26

1) L’exonucléase clive des parties des segments complémentaires, autant chez l’insert que chez le plasmide;
2) La polymerase et la ligase aide à la jonction entre les deux segments, ce qui créé un ADN circulaire entièrement duplex.

Question 27

Vrai ou faux? L’exonucléase est thermostable.

Answer 27

Faux. La polymerase et ligase sont thermostables, mais pas l’exonucléase.