2 - Clonage, technologie de l'ADN recombinant

Question 1

Comment est nommé le plasmide après l’insertion du gène d’intérêt?

Answer 1

Plasmide recombinant.

Question 2

Quels sont les éléments nécessaires pour le clonage de l’ADN dans un plasmide ou vecteur (4)?

Answer 2

1) Marqueur de sélection;
2) Origine de réplication;
3) Polylinker (site de clonage);
4) L’ADN/gène d’intérêt (ou insert).

Question 3

Quelles sont les étapes lors du clonage de l’ADN d’intérêt dans le plasmide? (4)

Answer 3

1) Digestion-ligation;
2) Transformation, sélection et amplification;
3) Purification de l’ADN recombinant;
4) Analyse.

Question 4

Quelles sont les activités de l’ADN polymérase? (3)

Answer 4

1) Polymérase 5’ à 3’ ;
2) Exonucléase 5’ à 3’ ;
3) Exonucléase 3’ à 5’ ;

Question 5

Plusieurs techniques servent au clonage et à son analyse. Quels sont les trois étudiés en profondeur dans le cours?

Answer 5

1) Polymerase chain reaction (PCR);
2) Extraction et quantification d’ADN;
3) Gel d’agarose pour analyser des fragments d’ADN.

Question 6

Quelle est l’utilité de la PCR?

Answer 6

Amplifier et modifier un gène d’intérêt.

(tbh j’ai mit cette carte pour donner un 5 fastoche LOL)

Question 7

Qu’est-ce que le principe de dénaturation dans la PCR?

Answer 7

Rupture de la structure double hélice de l’ADN.

Question 8

Qu’est-ce que le principe de l’hybridation dans la PCR?

Answer 8

Reformation de liens entre bases azotées, suivant ainsi à la retrouvaille de la structure double hélice de l’ADN.

Question 9

Quels sont les facteurs pouvant influencer l’hybridation des acides nucléiques? (4)

Answer 9

1) Composition en base de la région (négatif vs positif);
2) Degré de complémentarité des séquences à s’hybrider;
3) Température;
4) Composition en sel de la réaction d’hybridation.

Question 10

Vrai ou faux? La quantité de ponts hydrogène influence le niveau d’hybridation.

Answer 10

Vrai.

Question 11

Vrai ou faux? Plus le niveau en GC est haut, plus l’hybridation sera efficace. Si vrai, explique pourquoi.

Answer 11

Vrai.

Cela est dû au fait que l’appariement de bases GC forme 3 ponts hydrogène (au lieu de 2 entre AT), ce qui augmente les chances d’une hybridation efficace.

Question 12

Quel est le calcul pour l’approximation d’oligonucléotides?

Answer 12

Tm = 2(A+T) + 4(G+C)

Question 13

Où se situe la température optimale d’hybridation?

Answer 13

5°C en dessous de la température de fusion (Tm).

Question 14

Si les protéines dénaturent sous hautes températures, comment est-ce que la prolongation est possible?

Answer 14

Parce que l’ADN polymérase utilisée est résistante aux hautes températures (exemple: taq polymérase).

Question 15

Quelle est la première étape de la PCR?

Answer 15

La dénaturation des brins d’ADN. Sous une température entre 94-96°C pour une à plusieurs minutes, les brins sont séparés.

Question 16

Quelle est la deuxième étape de la PCR?

Answer 16

Les amorces s’attachent à leurs bases complémentaires, ce qui permet de démontrer quelle partie de l’ADN sera amplifiée. La température sera entre 50-65°C pour une à plusieurs minutes.

Question 17

Quelle est la troisième étape de la PCR?

Answer 17

La température est augmentée à 72°C, ce qui permet à la Taq polymérase de s’attacher aux sites des amorces et de synthétiser le nouveau brin d’ADN.

Question 18

Quelle est la quatrième étape de la PCR?

Answer 18

La température est augmentée à 94-96°C dans le but de dénaturer l’ADN (comme à la première étape). Les étapes précédentes sont répétées selon le degré d’amplification désiré.

Question 19

À partir de quel cycle obtiendrions-nous le fragment désiré?

Answer 19

Le troisième cycle, puisque c’est à celui-ci que les segments seront complètement artificiels (leur amplification sera due à des brins précédemment traduits).

Question 20

L’amplification exponentielle sera observée à partir de quel cycle?

Answer 20

Le troisième.

Question 21

Vrai ou faux? Un vieil appareil à PCR est composé de 2 bains chauffants.

Answer 21

Faux. Il est composé de 3 bains chauffants: 1 pour la dénaturation, 1 pour l’hybridation et 1 pour la polymérisation.

Question 22

Vrai ou faux? Les appareils à PCR utilisés dans les laboratoires d’enseignement sont munis d’une technologie avancée, ce qui veut dire que les étapes d’amplification sont automatisées.

Answer 22

Vrai.

Question 23

Quelle est l’importance de la fidélité de l’ADN polymérase?

Answer 23

La fidélité concerne le nombre d’erreurs par nucléotide incorporé. Si la polymérase fait plusieurs erreurs, il n’est pas intéressant de l’utiliser, car elle fera des erreurs dans la réplication du brin codant (ce qui est contre le principe d’amplification).

Question 24

Vrai ou faux? Les ADN polymérases sont obtenues à partir d’organismes psychrophiles.

Answer 24

Faux. Les ADN polymérases sont obtenues à partir de leur isolation à partir d’organismes thermophiles (vivant dans environnements à très hautes températures).

Question 25

Qu’est-ce que la processivité?

Answer 25

Le nombre de nucléotides incorporés par liaisons non-spécifiques à l’ADN.

Question 26

Quelle est la fonction du domaine de liaison?

Answer 26

Augmenter l’association de polymérase à l’ADN.

Question 27

Quelle est la fonction du domaine de rétention?

Answer 27

Garder la polymérase sur l’ADN pendant la polymérisation.

Question 28

À partir de quels types de structures génétiques est-ce possible d’amplifier via PCR? (2)

Answer 28

1) ADN isolé;
2) ARNm isolé.

Question 29

Comment se nomme le processus qui coupe les introns du pré-ARNm?

Answer 29

Épissage.

Question 30

Quels sont les éléments nécessaires afin d’amplifier un ARNm? (4)

Answer 30

1) Première amorce;
2) Reverse transcriptase;
3) dNTPs;
4) Deuxième amorce.

Question 31

Vrai ou faux? Faire une amplification par PCR d’un ARNm permet l’obtention de clones génomiques.

Answer 31

Faux. Une amplification par PCR à partir d’un ARNm mène à l’obtention de clones d’ADNc.

Question 32

Quelle est la fonction de la reverse transcriptase?

Answer 32

Permet de générer un ADNc à partir d’ARN.

Question 33

Quels sont les différents types d’amorces possibles? (3)

Answer 33

1) Amorce oligo dT;
2) Amorce spécifique;
3) Amorce aléatoire.

Question 34

Quel est le but de faire une électrophorèse sur gel d’agarose?

Answer 34

Dans le but de séparer l’ADN par taille.

Question 35

Vrai ou faux? L’association de l’ADN sur le gel d’agarose avec petits canaux est de type non-covalente.

Answer 35

Vrai.

Question 36

Le déplacement de l’ADN sur le gel se fait de quel node à l’autre?

Answer 36

Négatif à positif.

Question 37

L’ADN est chargé négativement ou positivement?

Answer 37

Négativement.

Question 38

Quelle est la première étape pour l’électrophorèse sur gel d’agarose?

Answer 38

Gel d’agarose liquide (donc chaud) est vidé, et un peigne (afin de former les puits) est déposé.

Question 39

Quelle est la deuxième étape pour l’électrophorèse sur gel d’agarose?

Answer 39

Après que le gel soit solidifié, les échantillons sont déposés dans les puits (après avoir été mélangés au tampon de chargement).

Question 40

Quelle est la composition du tampon de chargement? (2)

Answer 40

1) Glycérol (pour la densité);
2) Colorant (pour suivre la migration).

Question 41

À quoi servent les tampons de migration? Nomme un example.

Answer 41

Aide à faire la séparation sur l’agarose. Un example est le tampon TAE.

Question 42

Comment est-ce possible de visualiser les acides nucléiques après leur migration sur le gel d’agarose?

Answer 42

Une molécule fluorescente est ajoutée directement au gel (ou sinon par incubation dans un bain). Celle-ci s’intercale dans les acides nucléiques, permettant la visualisation.

Question 43

Vrai ou faux? Après la coloration, les acides nucléiques sont visibles à l’oeil nu.

Answer 43

Faux, il faut utiliser un transilluminateur couplé à une caméra CCD. La lumière UV est nécessaire.

Question 44

Quelle est la relation entre la distance parcourue sur le gel et la masse moléculaire?

Answer 44

Inversement proportionnelle au logarithme naturel.

Question 45

Vrai ou faux? La migration n’est pas impactée selon la concentration d’agarose utilisée.

Answer 45

Faux. Plus la concentration augmente, plus la migration diminue.

Question 46

Sans digestion avec enzymes de restriction, quelles sont les possibles formes observées dans les puits? (2)

Answer 46

1) Cercle relâché;
2) Molécule surenroulée.

Question 47

Quelle est la principale différence entre les gels d’agarose et les gels de polyacrylamide?

Answer 47

La résolution permet une meilleure observation de petits morceaux d’ADN.

Question 48

À partir des cellules, quelle est un résumé des étapes à entreprendre afin d’extraire l’ADN génomique?

Answer 48

1) Lyse cellulaire (avec détergents);
2) Digestion protéique (avec protéases);
3) Digestion ARN (avec ARNases);
4) Séparation entre protéines et ADN (avec solutions haute teneur en sels);
5) Précipitation ADN (avec éthanol).

Question 49

À partir de quelle formule la concentration de l’ADN peut-elle être déterminée? Quelle est la longueur d’onde utilisée?

Answer 49

Beer-Lambert, avec une absorbance à 260 nm.

Question 50

À partir de quelle formule la contamination protéique peut-elle être déterminée? Quelle est la longueur d’onde utilisée?

Answer 50

Beer-Lambert, avec une absorbance à 280 nm.

Question 51

Comment est-ce que la pureté de l’ADN peut être estimée?

Answer 51

Par le ratio 280/260, ce qui devrait donner une valeur entre 1.7-1.9.

Question 52

Est-ce qu’il y a une autre façon de mesurer la concentration d’ADN? Si oui, quelle est-elle?

Answer 52

Oui, par migration sur gel d’agarose avec agents intercalaires fluorescents. Comparaison avec courbe standard.