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Travaux pratiques 2 > 3 - Clonage: technologie de l'ADN recombinant > Flashcards

3 - Clonage: technologie de l'ADN recombinant Flashcards

1
Q

Quels sont les rôles et caractéristiques de l’origine de réplication (Ori) dans un plasmide?

A
  • Site unique de démarrage de la réplication.
  • Détermine le nombre de copies par bactérie.
  • Plus petit segment d’ADN capable de se répliquer de façon autonome.
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Q

Quel est l’avantage d’avoir un site Ori riche en nucléotide A et T?

A

Puisque ces nucléotides font que 2 ponts H, c’est plus facile à ouvrir.

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3
Q

Vrai ou Faux.
Si on veut utiliser deux plasmides, ils doivent avoir deux Ori du même groupe d’imcompabilité.

A

Faux,
Il faut des Ori de groupes différents.

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4
Q

Quel est l’impact du nombre de copies d’un plasmide par bactérie?

A
  • Il influence l’expression des gènes portés par le plasmide.
  • Plus le nombre est petit, plus on a de contrôle sur le système d’expression.
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5
Q

Quels types de marqueurs de sélection existent ?

A

Marqueurs de sélection positive et négative, comme les antibiotiques et LacZ.

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6
Q

À quoi servent les marqueurs de sélection ?

A

À identifier et sélectionner les bactéries ayant incorporé des vecteurs recombinants.

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7
Q

Où sont regroupé les sites de clonage?

A

Polylinkers ou site de clonage multiple (MCS)

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8
Q

Où se retrouve les polylinkers?

A

à coté des ADN importants:
- site de liaison des ribosomes
- promoteur de transcription

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9
Q

Quelles sont les caractéristiques des sites de restriction dans un vecteur?

A

Ils sont uniques et permettent la coupure de l’ADN à des endroits spécifiques.

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10
Q

Que peut-on retrouver dans la séquence nucléotidique du polylinker?

A
  • Promoteur de transcription
  • Étiquette d’histidine
  • Terminaison de transcription
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11
Q

Quelles sont les étapes de la création d’ADN recombinant?

A
  1. Digestion - Ligation,
  2. Transformation, Sélection et Amplification,
  3. Purification de l’ADN recombinant,
  4. Analyse.
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12
Q

Qu’est-ce que les enzymes de restriction coupent?

A

L’ADN à des sites spécifiques constitués de séquences palindromiques sur les deux brins.

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13
Q

Qu’est-ce qu’une exonucléase?

A

Une enzyme qui libère par hydrolyse le nucléotide situé à l’extrémité 5’ ou 3’.

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14
Q

Quelle est la fonction des endonucléases?

A

Elles hydrolysent une liaison ester interne.

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15
Q

Quels sont les mécanismes de défense bactérien?

A
  • Le système de restriction
  • Modification bactérien
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16
Q

Comment fonctionne le systéme de défense des bactéries contre les phages?

A
  • Des enzymes modifient l’ADN de la bactérie pour le protéger.
  • Des enzymes de restriction clivent l’ADN du phage.
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17
Q

Sur quoi est basé le système de nomenclature des enzymes de restriction?

A

Sur le genre, l’espèce, la souche et l’ordre d’identification dans la bactérie.

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18
Q

Comment sont les extrémités générées par les enzymes de restriction?

A

Elles peuvent être des extensions 5’ ou sans extension.

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19
Q

Quelle est la structure des coupures à bouts francs?

A

Elles laissent des extrémités droites sans chevauchement.

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20
Q

Quelles sont les caractéristiques des coupures à bouts cohésifs/collant?

A

Elles génèrent des extrémités qui peuvent s’associer facilement avec d’autres fragments d’ADN par complémentarité des bases.

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21
Q

Quel est un exemple d’enzyme qui effectue des coupures à bouts cohesifs?

A

Sma I.

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22
Q

Quel est un exemple d’enzyme qui effectue des coupures à bouts cohésifs?

A

EcoR I.

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23
Q

Vrai ou Faux.
Il est préférable d’utiliser les coupures à bouts cohésifs pour un clonage efficace.

A

Vrai.

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24
Q

Quel est le rôle des ADN méthylases?

A

Elles transfèrent des groupements méthyl du S-adenosylmethionine à une adénine ou cytosine.

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25
Q

Vrai ou Faux.
Les méthylases des eucaryotes sont associées aux systèmes de restriction/modification. Elles permettent de protéger l’ADN bactérienne.

A

FAUX.
Les méthylases des PROCARYOTES sont associées aux systèmes de restriction/modification. Elles permettent de protéger l’ADN bactérienne.

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26
Q

Quels types de méthylases sont présents dans la majorité des souches de E. Coli utilisées en laboratoire?

A
  • Dam,
  • Dcm
  • EcoK1.
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27
Q

Quel est l’effet de la méthylation sur les sites de restriction?

A

Elle modifie les sites de restriction, empêchant certaines enzymes de cliver l’ADN.

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28
Q

Quel est un exemple d’enzyme de restriction et son site de clivage et ce qui se passe après une méthylation?

A

1- MboI clive GATC.
2 - Méthylation par Dam: GAmTC n’est pas clivé par Mbol.

29
Q

Que faire si une enzyme ne coupe pas l’ADN?

A

Vérifier sa sensibilité à la méthylation et utiliser des bactéries déficientes en méthylases spécifiques.

30
Q

Vrai ou Faux.
Seul le plasmide linéarisé (digestion avec enzymes de restriction) migre en fonction de sa masse moléculaire.

A

Vrai.
Les plasmides non digéré (cercle relâche ou molécule surenroulée) ne migrent pas en fonction de la masse moléculaire.

31
Q

Comment fonctionne l’ADN ligase?

A
  • Catalyse la formation de ponts phosphodiester entre deux nucléotides dans l’ADN double brin.
  • Connecte le 3’ OH au 5’ phosphate en utilisant l’ATP (ou NAD+) comme cofacteur.
32
Q

Quelle est l’étape la plus problématique dans la procédure de clonage et pourquoi?

A
  • L’étape de ligation avec l’ADN ligase.
  • Toutes les extrémités de l’ADN doivent se rejoindre et rester stable assez longtemps pour être souder par ADN ligase.
33
Q

Donnez en gros le mécanisme d’action de la T4 ADN ligase.

A
  1. Adenylylation de l’ADN ligase (liaison covalante entre enzyme-AMP)
  2. Activation of 5’ phosphate in nick (transfert de l’AMP à extrémité 5’ phosphate de l’ADN → ADN ligase catalyse l’attaque du 3’OH sur 5’phos)
  3. Displacement of AMP seals nick (libération AMP → nouveau lien phosphodiester pour sceller l’ADN)
34
Q

Quel cofacteur est associé à l’ADN ligase T4?

A

NAD+ (nicotinamide adénine dinucléotide).

35
Q

Qu’est-ce que l’appariement des bases du bout collant et quels est son effet sur la ligation?

A
  • C’est le rapprochement du 5’ P et du 3’ OH qui peuvent être ligués.
  • Il favorise la ligation.
36
Q

Comment la ligation des bouts francs se compare-t-elle à celle des bouts collants?

A

La ligation des bouts francs est moins efficace.

37
Q

Qu’est-ce que le clonage avec des ADN à bouts collants permet si les enzymes sont différentes?

A
  • Il permet un clonage directionnel.
  • Nécessité d’avoir les mêmes enzymes pour l’insert et le vecteur, sauf pour des enzymes compatibles.
38
Q

Qu’est-ce que le clonage avec des ADN à bouts francs implique?

A

Il entraîne une insertion non-directionnelle.

39
Q

Expliquez la compatibilité des bouts collants générés par des enzymes différentes.

A

Même si les enzymes sont différentes dans leur lieux de coupures, si elles forment des fragments avec des bouts qui sont complémentaires, on peut avoir un produit ligué.

40
Q

Que se passe-t-il au niveau du vecteur lors de la ligation avec des bouts francs?

A

La probabilité que le vecteur se referme sur lui-même est plus grande que celle d’incorporer l’insert.

41
Q

Que fait-on pour pallier le problème des bouts francs lors de la ligation?

A

On met plus d’insert que de vecteurs pour s’assurer que le vecteur ne se referme pas.

42
Q

On peut faire autre chose pour les bouts francs. Expliquez ce que c’est.

A
  • Puisque la ligation met en jeu, le 5’ phosphate et le 3’ hydroxyle; en enlevant le 5’phos, on inhibe la ligation entre le vecteur.
  • Pour ce faire, on traite le vecteur avec une phosphatase (CIP).
  • Seul le brin impliquant le 5’P de l’insert est ligué mais le brin avec 5’OH du vecteur ne l’est pas → défaut réparé dans la bactérie après transformation par les enzymes de réparation.
43
Q

Quelle activité certaines ADN polymérases possèdent-elles?

A

Une activité adényl transférase qui ajoute des A auz extrémités 3’ des produits PCR.

44
Q

Qu’est-ce que la hybridation T/A?

A

C’est un système qui facilite la ligation en mimant des bouts collants.

45
Q

Quel est le rôle du système pGEM dans la hybridation T/A?

A

Il utilise une thymine de chaque côté pour permettre l’insertion.

46
Q

Quel type de hybridation est possible avec la méthode T/A?

A

Une hybridation non directionnelle dans deux orientations.

47
Q

Quel est le rôle de la topoisomérase I dans le système TOPO? AAAAAAAAHHHHH 29 à 32

A

Elle facilite la ligation des produits PCR.

48
Q

Donnez les caractéristiques de E.coli. (5)

A
  • Bactérie Gram-négative.
  • Pas de membrane nucléaire
  • Chromosome circulaire avec site d’attachement à la membrane et une ori unique.
  • K12: première souche utilisée.
  • Supporte la replication de plasmides.
49
Q

Donnez toutes les modifications de E.coli K12 pour favoriser le clonage. (3)

A
  • Élimination des systèmes de restriction/modification
  • Système de recombinaison de l’ADN modifiés pour prévenir les réarrangement (RecA-)
  • Activités endonucléases mutées pour augmenter le taux de production de plasmide (EndA-).
50
Q

Qu’est-ce que la transformation dans le contexte des bactéries?

A

C’est le processus qui permet de faire entrer les vecteurs dans les bactéries.

51
Q

Comment rendre les bactéries compétentes à la transformation?

A
  • Par des méthodes chimiquement compétentes (CaCl2 froid)/Par choc thermique (42°C)
  • Électrocompétentes (H2O froide) par électroporation.
52
Q

Quelle est l’efficacité de transformation?

A

C’est le nombre de bactéries transformées par 1 microgramme d’ADN.

53
Q

Expliquez en gros la préparation de bactéries chimiquement compétentes. (6)

A
  1. Prendre une culture de E.coli en phase de croissance log et la centrifugé.
  2. Resuspendre le culot bactérien dans solution CaCl2 et mettre sur glace (bactérie fragile).
  3. Rajouter le plasmide et mettre sur glace.
  4. Heat shock. (avec de l’eau “chaude”)
  5. Mettre dans une culture en milieu sans antibiotique
  6. Mettre dans un plate avec antibiotique et calculer la croissance.
54
Q

Expliquez en gros la préparation de bactéries éléctrocompétente. (7)

A
  1. Prendre une culture de E.coli en phase de croissance log et la centrifugé.
  2. Resuspendre le culot bactérien dans eau stérile (sans charge) et mettre sur glace (bactérie fragile).
  3. Centrifuger et resuspendre culot dans eau stérile.
  4. Rajouter le plasmide.
  5. Electroshock
  6. Culture en milieu sans antibiotiques
  7. Mettre dans un plate avec antibiotique et calculer la croissance.
55
Q

Quel est le rôle des antibiotiques dans le contexte des plasmides?

A

Ils permettent de sélectionner les bactéries contenant le plasmide.

56
Q

Quel est le rôle du gène de résistance Amp R?

A

Permet la sélection du vecteur sur milieu avec ampicilline.

57
Q

Quel est le rôle du gène de résistance Tet R?

A

Fournit une résistance supplémentaire aux antibiotiques. (sélection négative)

58
Q

Selection négative par les antibiotiques.

Dites si les exemples peuvent pousser sur milieu avec ampicilline et tetracycline et une explication du phénomène.
1- Plasmide avec ampR et tetR sans insert
2- Plasmide avec ampR et tetR avec insert.

A

1- Oui
2- Non
Dans le 2e exemple, le gène de résistance est coupé par l’insert.

59
Q

Sélection négative par les antibiotiques.

Dans une pétri contenant seulement de l’ampicilline, des colonies poussent. On fait un duplicata sur une pétri avec un milieu contenant de l’ampicilline et de la tetracycline. Certaines colonies ne poussent pas. Dites quelles sont les bactéries que l’on recherche.

A

Les bactéries n’ayant pas pousser sur le milieu contenant le tetracycline ont intégré l’insert et sont donc les bactéries transformées.

60
Q

Comment faire de la sélection positive?

A
  • Sélection par antibiotique
  • Sélection blanc/bleu.
61
Q

Qu’est-ce que le lacZα?

A
  • Le peptide a (60 premiers acides aminés) de la β-galactosidase.
  • permet la complémentation α (transforme X-Gal en produit bleu)
  • code pour la b-galactosidase.
62
Q

Comment fonctionne la sélection positive Blanc/Bleu?

A

Les colonies de bactéries contenant un plasmide avec un insert apparaissent en blanc, tandis que celles sans insert apparaissent en bleu.

63
Q

Quel est le rôle du gène lacZ dans la sélection positive Blanc/Bleu? AAAAHHHHHHH DIAPO 48-53

A

Il permet de différencier les colonies en fonction de la présence ou de l’absence d’un insert dans le plasmide.

64
Q

Quelles sont les étapes de la préparation d’ADN plasmidique?

A
  1. Lyse membranaire cellulaire - dénaturer ADN
  2. Séparer l’ADN plasmidique des protéines de l’ADN chromosomal
  3. Mesure de concentration
  4. Miniprep = petite qt, midi, maxi, giga…
65
Q

Comment on fait la lyse membranaire cellulaire?

A
  • mécanique,
  • détergent (SDS),
  • lysozyme,
  • lyse alcaline.
66
Q

Comment on fait pour séparer l’ADN plasmidique des protéines et de l’ADN chromosomal?

A
  • neutralisation pH (ségrégation par conformation)
  • phenol extraction + ethanol precipitation.
  • silica-bead methods
67
Q

Comment mesurer la concentration d’ADN?

A

Par absorption UV à 260 nm.

68
Q

Donnez des étapes pour la lyse et la séparation.

A
  1. SDS (détergent) lyse les bactéries: NaOH dénature ADNc et ADNp en ADNsimplebrin.
  2. Acétate de potassium et acide acétique neutralise pH et précipite lipides et grosse mol. petite renaturation ADNc qui reste bloquer dans le précipité.
  3. Séparation du plasmide par précipitation, membrane de silice, lavage à l’éthanol et élution à l’eau.

Travaux pratiques 2 (4 decks)

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