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Travaux pratiques 2 > 1 - Clonage, technologie de l'ADN recombinant > Flashcards

1 - Clonage, technologie de l'ADN recombinant Flashcards

1
Q

Qu’est-ce qu’une multiplication à l’identique en biologie?

A

C’est une conservation parfaite de l’information génétique.

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2
Q

Quels sont les deux types de clonage?

A
  • Clonage cellulaire (échelle cellulaire)
  • Clonage reproductif (échelle de l’organisme entier).
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3
Q

Comment se fait l’amplification d’un fragment d’ADN?

A

Par des micro-organismes après son insertion dans un vecteur.

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4
Q

Qu’est-ce que le clonage en biotechnologie?

A
  • C’est une technologie de l’ADN recombinant.
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5
Q

Qu’est-ce que la technologie de l’ADN recombinant/génie génétique?

A

Ensemble des techniques de construction d’un ADN recombinant et ses utilisations.

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6
Q

Qu’est-ce que l’ADN recombinant?

A

C’est une combinaison entre l’ADN d’un organisme donneur et celui d’un vecteur (qui peut venir d’une espèce totalement différente).

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7
Q

Que peuvent exprimer les cellules modifiées ayant intégré un ADN recombinant?

A

Une protéine recombinante, par exemple d’une espèce différente ou une protéine modifiée (mutée, fusionnée à une étiquette).

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8
Q

Quel est l’objectif principal de la technologie de l’ADN recombinant?

A

Isoler et amplifier à l’identique une séquence d’ADN d’intérêt.

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9
Q

Donnez les applications de la technologie d’ADN recombinant. (3)

A
  • Analyser l’ADN génomique, le séquençage de l’ADN
  • Analyser la structure et l’expression d’ARNm
  • Expression des protéines recombinantes (bactéries, système, modèle animal)
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10
Q

Donnez les 5 trucs qu’on peut faire l’expression des protéines recombinantes.

A
  • Étudier la fonction et la signalisation des protéines.
  • Étudier les intéractions prot-prot
  • Déterminer la structure des protéines
  • Produire des Ag pour générer des Ac
  • Générer des vaccins et médicaments recombinants.
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11
Q

Donnez 3 exemple d’utilisation de technologie d’ADN recombinant.

A
  • Synthèse d’insuline humaine par génie génétique
  • Plantes transgéniques
  • ndc p17
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12
Q

Quelles techniques permettent de modifier l’environnement génétique des organismes?

A

Un nombre restreint de techniques inspirées de l’étude de l’ADN, l’ARN, des bactéries et des virus.

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13
Q

Quels sont les principes de base de l’ADN recombinant? (3)

A
  • L’enzymologie des acides nucléiques,
  • la complémentarité des bases
  • la possibilité d’introduire de l’ADN dans des organismes.
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14
Q

Donnez les outils du clonage. (4)

A

1- vecteurs de clonage
2- cellules hôtes
3- enzymes pour manipuler l’ADN
4- techniques reliées au clonage et à l’analyse

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15
Q

Qu’est-ce qu’un vecteur en biologie moléculaire? Comment appelle-t-on l’ADN inséré dans un vecteur?

A
  • C’est l’ADN dans lequel on insère le fragment d’ADN à étudier.
  • Insert, ADN étranger ou ADN exogène.
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16
Q

Quels types d’ADN sont généralement utilisés comme vecteurs?

A

Des plasmides ou des bactériophages.

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17
Q

Donnez la définition d’un vecteur de clonage.

A

Une séquence d’ADN permettant la propagation, la sélection et la modification d’une séquence d’ADN d’intérêt.

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18
Q

Qu’est-ce qu’un plasmide et leur taille maximale?

A
  • Un petit fragment d’ADN circulaire présent dans la cellule bactérienne, indépendant du génome bactérien.
  • Environ 10 kb.
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19
Q

Comment se répliquent les plasmides?

A

De façon autonome dans un organisme.

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20
Q

Qu’est-ce qu’un phage et quelle est la taille des phages utilisés comme vecteurs?

A
  • Virus qui infectent des bactéries.
  • Entre 25 et 100 kb.
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21
Q

Quel est un exemple de bactériophage modifié et sa particularité?

A
  • Le bactériophage M13.
  • Possède un génome ADN simple brin. (après infection, synthèse de brin complémentaire ⮕ se comporte comme plasmide dans bactérie)
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22
Q

Qu’est-ce qu’un cosmide et leur taille d’insertion possible?

A
  • Un vecteur artificiel constitué d’un plasmide hybride contenant la séquence cos du phage lambda.
  • Jusqu’à environ 45 kb.
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23
Q

Quelle est la particularité des cosmides?

A

Combine les avantages de clonage plasmides et augmente la taille d’insertion possible dans les phages lambda.

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24
Q

Quels sont d’autres types de vecteurs de clonage et leur taille (plus petit au plus grand)?

A
  • BAC (chromosome bactérien artificiel ; 300 kb)
  • YAC (chromosome de levure artificiel ; 1000 kb)
  • HAC (chromosome humain artificiel ; 6-10 Mb)
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25
Q

Vrai ou Faux.
L’ADN étranger/d’intérêt prend la place des éléments non essentiels dans le vecteur.

A

Vrai.
seulement l’ADN nécessaire à la réplication/répartition/stabilité cellulaire est gardé dans le vecteur.

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26
Q

Quels sont les composants principaux d’un cosmide?

A

Des extrémités cohésives et un plasmide.

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27
Q

Quels sont les éléments distinctifs du BAC?

A
  • F plasmide (facteur de fertilité)
  • Conjugaison (transfert de gènes entre bactéries)
  • gènes par pour répartir l’ADN entre cellule filles.
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28
Q

Comment choisit-on les vecteurs?

A

Selon la taille et les besoins de recherche.

29
Q

Classez les vecteurs de clonage (3) selon le nombre qu’il faudrait utiliser pour un étude du génome humain. (plus grand au plus petit).

A

plasmide > cosmide > BAC

30
Q

Donnez la définition d’une cellule hôte.

A

Cellule hébergeant un matériel génétique étranger apporté par un virus, un plasmide, un ADN recombiné in vitro, ou une cellule entière.

31
Q

Donnez les catégories de cellules hôtes et un exemple. (4)

A
  • bactérie (E.coli)
  • levure (S. cerevisae)
  • cellules de mammifères (chinese hamster ovary CHO)
  • cellules d’insectes
32
Q

Quels sont les avantages des bactéries comme cellules hôtes?

A
  • Nombreux vecteurs plasmidiques connus et utilisable
  • Culture en masse dans les fermenteurs et taux d’expression élevés.
33
Q

Quels sont les inconvénients des bactéries comme cellules hôtes?

A
  • secrètent mal les protéines:
  • éclatement de bactéries
  • pas de modifications post-traductionnelles.
34
Q

Quels sont les avantages des levures comme cellules hôtes?

A

Elles permettent des modifications post-traductionnelles.

35
Q

Quels sont les inconvénients des levures comme cellules hôtes?

A

La sécrétion des protéines est difficile et le rendement est moins bon.

36
Q

Quels sont les avantages des cellules de mammifères comme cellules hôtes?

A
  • Culture de masse en bioréacteurs
  • production de protéines complexes.
37
Q

Quels sont les inconvénients des cellules de mammifères comme cellules hôtes?

A

Elles sont chères et ont un rendement plus faible.

38
Q

Quel rôle jouent les bactéries dans l’amplification de l’ADN?

A

Elles permettent l’amplification à l’identique de séquences d’ADN sous forme de plasmide.

39
Q

Donnez les enzymes qui servent à copier. (2)

A
  • ADN polymérase
  • ARN polymérase
40
Q

Donnez les enzymes qui servent à couper. (5)

A
  • 5’→3’ exonucléase
  • 3’→5’ exonucléase
  • endonucléase
  • topoisomérase
  • recombinase
41
Q

Donnez les enzymes qui servent à coller. (4)

A
  • ADN ligase
  • ARN ligase
  • topoisomérase
  • recombinase
42
Q

Donnez les enzymes qui servent à modifier. (3)

A
  • phosphatase
  • phosphokinase
  • terminal tranferase
43
Q

Vrai ou Faux.
Les polymérase colle de 3’→5’.

A

FAUX.
L’ADN polymérase et l’ARN polymérase colle de 5’→3’.

44
Q

Quelles sont les techniques reliées au clonage et à l’analyse? (8)

A
  • Extraction et quantification d’ADN,
  • PCR pour amplifier et modifier gène d’intérêt
  • construction et modification d’un vecteur,
  • transformation pour insérer plasmid dans e.coli
  • gel d’agarose pour analyser fragment ADN
  • carte de restriction d’un plasmide
  • séquençage d’ADN,
  • hybridation (Northern Blot)
45
Q

Donnez la “formule” pour le clonage d’ADN dans un plasmide/vecteur.

A

vecteur/plasmide + ADN/gène d’intérêt, ou insert + enzymes = plasmide recombinant.

46
Q

Quels sont les composantes d’un vecteur ou plasmide dans le clonage d’ADN?

A
  • Marqueur de sélection
  • Origine de réplication
  • Polylinker, site de clonage.
47
Q

Qu’est-ce qu’un marqueur de sélection?

A

gène qui codent pour la résistance aux antibiotiques.

48
Q

Quel est le rôle de l’origine de réplication dans un plasmide?

A

séquence pour commencer la réplication plasmidique.

49
Q

Qu’est-ce qu’un polylinker/site de clonage ?

A

site de restriction où on coupe et insère le gène d’intérêt.

50
Q

Qu’est-ce qu’un plasmide recombinant?

A

Un plasmide qui contient un gène d’intérêt inséré.

51
Q

Quels sont les moyens d’obtenir de l’ADN à cloner? (4)

A
  • À partir de l’ADN génomique,
  • d’un autre plasmide ou vecteur,
  • par amplification (PCR)
  • par synthèse d’acides nucléiques (synthèse in silico) de séquence connue.
52
Q

Dans quel cas on utilise la PCR?

A

lorsque la quantité de matériel est limitée ou pour obtenir un fragment spécifique.

53
Q

Quelle est la première étape dans le clonage?

A

DIGESTION - LIGATION.
aka on fait l’ADN recombinant avec le plasmide et l’insert.

54
Q

Quelle est la deuxième étape après la digestion et la ligation?

A

TRANSFORMATION, SÉLECTION ET AMPLIFICATION:
on met les bactéries dans un agar qui contient des antibiotiques pour garder que celles qui ont le plasmide et qui peuvent croitre.

55
Q

Quelle étape suit la transformation dans le processus d’ADN recombinant?

A

PURIFICATION DE L’ADN RECOMBINANT:
inocule les bactéries dans un bouillon avec antibiotiques, donc on augmente le nb de bactéries avec ADN recombinant.

56
Q

Quelle est la dernière étape du processus d’ADN recombinant?

A

ANALYSE:
on vérifie le clonage avec le séquençage.

57
Q

La structure de l’ADN polymérase ressemble à …

A

une main droite.

58
Q

Quelles sont les trois activités de l’ADN polymérase?

A
  1. Polymérase 5’ à 3’,
  2. Exonucléase 3’ à 5’,
  3. Exonucléase 5’ à 3’.
59
Q

Quel est le rôle du site actif de la polymérase?

A

Il permet la copie de l’ADN matrice et l’ajout de l’amorce (nouvel ADN).

60
Q

Quel terme est utilisé pour décrire la modification d’une séquence d’ADN?

A

Édition.
l’exonucléase corrige les erreurs.

61
Q

Quel est le rôle de l’ADN polymérase?

A

Catalyse la synthèse d’un nouveau brin complémentaire à partir d’une matrice d’ADN simple brin et de dNTPs.

62
Q

Comment se produit l’attaque nucléophile lors de la synthèse de l’ADN?

A

Le 3′- OH naissant attaque l’a-phosphate du dNTP entrant.

63
Q

Dans quel sens l’ADN est-il synthétisé?

A

Dans le sens 5′ à 3′.

64
Q

Vrai ou Faux.
Le mécanisme catalytique de l’ADN polymérase dépend de 2 Mg2+.

A

Vrai.
(a et b)

65
Q

Quel est le rôle du métal A dans le mécanisme catalytique?

A
  • Établir un pont entre le 3’ OH et le PO4 2- et activer le 3’ OH.
  • Active le 3’ OH.
66
Q

Quel est le rôle du métal B dans le mécanisme catalytique?

A
  • Orienter le dNTP lié,
  • Protéger les charges négatives de dNTP
  • Stabiliser l’état de transition.
67
Q

À quoi sert le ddCTP dans le mécanisme de synthèse?

A

L’ajout de ce nucléotide va arrêter la synthèse parce qu’il n’y a plus de OH à combiner.

68
Q

Quels sont les rôles de l’ADN polymérase en termes d’exonucléase 3’ → 5’? (2)

A
  • Hydrolyse la liaison entre O3’ et P pour laisser un 3’ - OH à l’extrémité du brin d’ADN.
  • Révision des erreurs de polymérase.
69
Q

Quels sont les rôles de l’ADN polymérase en tant qu’exonucléase 5’→3’?

A
  • Hydrolyse la liaison entre O3′ et P pour laisser un 3′ - OH à l’extrémité.
  • Supprime un nucléotide à la fois de l’extrémité 5’.
  • Déplacement du site de coupure (simple brin) → synthèse de brin retardé de l’ADN → réparation de l’ADN.

Travaux pratiques 2 (4 decks)

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