4η Διάλεξη A, Καθαρισμός -Απομόνωση και επίλυση δομής πρωτεϊνών Flashcards
Γιατί είναι απαραίτητος ο καθαρισμός μιας πρωτεΐνης;
Αποτελεί το πρώτο βήμα για την μελέτη και κατανόηση της λειτουργίας των πρωτεϊνών γιατί όταν θέλω να την παραλάβω από ένα εκχύλισμα ή σύνολο κυττάρων δεν μπορώ να χρησιμοποιήσω μείγμα γιατι δυσκολεύει τις μελέτες
Με βάση ποιους παράγοντες γίνεται ο διαχωρισμός και καθαρισμός των πρωτεϊνών ;
- διαλυτότητα (περισσότερο ή λιγότερο υδρόφιλες)
- μέγεθος(πλήθος και είδος αμινοξέων)
- φορτίο
- ικανότητα εκλεκτικής δέσμευσης σε διάφορα μόρια
Πως μπορώ μέσω της ενζυμικής δραστικότητας να εξακριβώσω την παρουσία μιας πρωτεΐνης και πως μετράται η ειδική δραστικότητα της ;
Έστω ότι ψάχνω μια συγκεκριμένη πρωτεΐνη σε ένα μείγμα και ξέρω ότι είναι ένζυμο , μέσω της μέτρησης ενζυμικής δραστικότητας μπορώ να εξακριβώσω της παρουσία της πρωτεΐνης (Α) (εάν δεν είναι ένζυμο θα πάρω μια άλλη φυσικοχημική ιδιότητα). Έπειτα μπορώ να μετρήσω την μάζα της καθαρής πρωτεΐνης, εάν σε συγκεκριμένο όγκο τότε και συγκέντρωση (Β). Η ειδική δραστικότητα είναι ο λόγος Α/Β. Κατά τον καθαρισμό αφαιρώ ουσίες και πρωτεΐνες του μείγματος που δεν με ενδιαφέρουν άρα σε κάθε στάδιο καθαρισμού η μάζα μειώνεται άρα ο λόγος Α/Β αυξάνεται. Παράλληλα μειώνεται και η (Α) γιατί χάνεται και ένα κομμάτι από την πρωτεΐνη μου.
Δώστε παράδειγμα μέτρησης ειδικής δραστικότητας
Η αντίδραση Γαλακτικό οξύ + NAD+ Πυροσταφυλικό + ΝΑDH + H+ καλαύεται απο το ένζυμο Γαλακτική αφυδρογονάση. Άρα εάν μετρήσω με φωτόμετρο την παραγωγή ΝΑDH ξέρω ότι η αντίδραση έχει πάει προς τα δεξιά άρα ότι υπάρχει το ένζυμο Γαλακτική αφυδρογονάση
Πως γίνεται ο διαχωρισμός των πρωτεϊνών με διαφορική φυγοκέντριση;
Η φυγόκεντρος δύναμη αναγκάζει τα συστατικά του δείγματος να μετακινούνται και τα βαρύτερα να πάνε στον πυθμένα. Αρχικά κάνω ομογενοποίηση(με μιξερ) στο μείγμα προκειμένου να καταστραφούν οι κυτταρικές μεμβράνες. Το σωληνάκι τοποθετείται κάθετα ,και καθορίζουμε είτε τις στροφές/ min ή τα g που θα δεχτεί το μείγμα (επιτ.βαρ). Με συνεχώς αυξανόμενη g και διάρκεια γίνεται κλασματικός διαχωρισμός των μερών του μείγματος. Στην αρχή σαν ίζημα έχουμε πυρηνικό κλάσμα , έπειτα μιτοχονδριακό κλάσμα και τέλος μικροσωματικό κλάσμα. Πριν την κάθε αύξηση της επιτάχυνση απορρίπτω το υπερκείμενο και κρατάω το ίζημα σε διαφορετικό σωληνάκι. Στο τελικό στάδιο το υπερκείμενο είναι καθαρό με όλα τα συστατικά του κυτταροπλάσματος. Άρα με την φυγόκεντρο έχω διαχωρίσει τα συστατικά του κυτταροπλάσματος από όλα τα υπόλοιπα συστατικά του κυττάρου
Πώς γίνεται διαχωρισμός των πρωτεϊνών με εξαλάτωση;
Κλασματόνονται (καθιζάνουν) οι πρωτεΐνες μέσω της χρήσης υψηλής συγκέντρωσης άλατος που έχει σαν αποτέλεσμα την μείωση της διαλυτότητας. Κάθε πρωτ θέλει διαφορετική συγκέντρωση άλατος για να μειωθεί η διαλυτότητα τους άρα ανάλογα την συγκένρωση άλατος που χρησιμοποιώ μπορώ να κλασματώσω διαφορετική πρωτεΐνη. Με αυτό τον τρόπο επίσης μπορώ να αυξήσω την συγκέντρωση σε αραιά διαλύματα πρωτεϊνών, απορρίπτοντας τον διαλύτη μετά την καθίζηση. Πιο συχνό άλας το θειικό αμμώνιο. Τέλος θα κάνω απομάκρυνση του άλατος με διαπίδυση. Η Διαπίδυση γίνεται με την χρήση σακούλας διαπίδυσης (ημιπερατή μεμβράνη) όπου τα μόρια της πρωτ παραμένουν μέσα ενώ τα μικρά μόρια (π.χ. άλατος) διαχέονται κατά την κατεύθυνση της βαθμίδωσης της συγκέντρωσης αφού η σακούλα περιέχει υψηλή Cαλ ενώ το εξωτερικό διάλυμα χαμηλή Cαλ.
Ποιά τα πλεονεκτήματα του καθαρισμού των πρωτεϊνών με χρωματογραφικές τεχνικές;
Απομόνωση πρωτεΐνης σε υψηλή καθαρότητα. (έχω διώξει όλα τα υπόλοιπα συστατικά του κυττάρου και στοχεύω την πρωτεΐνη που με ενδιαφέρει).
Τι περιλαμβάνει η χρωματογραφία διήθησης σε πηκτή ή μοριακού αποκλεισμού;
Όπου ένα δείγμα πρωτεϊνών σε πολύ μικρό συγκριτικά όγκο δείγματος τοποθετείται σε στήλη με πορώδεις κόκκους (υδατανθρακικά πολυμερή). Οι μεγάλες πρωτεΐνες εγκλοβίζονται και εμφανίζονται στην έξοδο της στήλης πριν από τις μικρές λόγω αδυναμίας εισχώρησης στο εσωτερικό των κόκκων του υλικού. Τα μικρά μόρια μπορούν να εισχωρήσουν στο εσωτερικό των κόκκων και καθυστερούν να φτάσουν στην έξοδο. Οι πρωτεΐνες ωθούνται μέσω του διαλύματος που τοποθετώ στην κορυφή.
Τι περιλαμβάνει η χρωματογραφία ιοντοανταλλαγής;
Διαχωρισμός με βάση το φορτίο, όπου μπορεί να γίνει Κατιοντοανταλλαγή (καρβοξυλομεθυλομάδα με κυτταρίνη) ή Ανιοντοανταλλαγή (διαιθυλο-αμινοαίθυλο-ομάδα με κυτταρίνη)
Κατιοντοανταλλαγή: Εάν το καθαρό φορτίο πρωτεΐνης σε pH 7 είναι θετικό δεσμεύεται σε στήλη που περιέχει καρβοξυλικά ιόντα. Αυτές με τα λιγότερα θετικά φορτία θα βγουν πρώτες. Έκλουση (απελευθέρωση των θετικά φορτισμένων) με αύξηση της συγκέντρωσης του NaCl στο buffer έκλουσης όπου τα Na+ συναγωνίζονται τα θετικά φορτία της πρωτεΐνης για τη δέσμευση στη στήλη.
Τι περιλαμβάνει η χρωματογραφία συγγένειας και τι επίδραση θα έχει μικρή αλλαγή συνθηκών;
Βασίζεται στην ικανότητα των πρωτεϊνών να προσδένονται εκλεκτικά με συγκεκριμένα μόρια (συγγένεια πρόσδεσης). Γίνεται χρήση πάλι πληρωτικού υλικού με κόκκους σε στήλη με διαφορά ότι πάνω στους κόκκους δεσμελυονται ομοιοπολικά και μόρια μιας χημικής ομάδας Χ (π.χ. γλυκόζη) που ξέρω ότι συνδέεται εκλεκτικά με την πρωτεΐνη μου. Έτσι καθώς το μείγμα των πρωτ περνάει από την στήλη δεσμεύονται συγκεκριμένες πρωτεΐνες και αυτές που δεν δεσμεύτηκαν απομακρύνονται με έκπλυση με ρυθμιστικό διάλυμα. Έκλουση της πρωτεΐνης που δεσμεύτηκε με προσθήκη υψηλής συγκέντρωσης διαλυτής μορφής του Χ (πχ σκέτη γλυκόζη χωρίς να είναι δεσμευμένη στους κόκκους) ή με αλλαγή συνθηκών για τη μείωση της συγγένειας πρόσδεσης της πρωτεΐνης (pH). Επίσης με μικρή αλλαγή των συνθηκών μπορώ να απομακρύνω και πρωτεΐνες που συνδέονται με γλυκόζη αλλά είτε πιο ασθενώς είτε σε άλλο pH πχ.
Τι γνωρίζετε για την HPLC: υγρή χρωματογραφία υψηλής πίεσης/ απόδοσης;
Με χρήση πακεταρισμένης στήλης (ήδη γεμισμένη) με λεπτόκοκκο υλικό πλήρωσης και καλό πακετάρισμα άρα απαιτείται περισσότερη πίεση για να διέλθουν οι πρωτεΐνες (μεγάλη διαχωριστική ικανότητα και ταχεία μέθοδος). Η στήλη μπορεί να είναι οποιασδήποτε μορφής από αυτές που είπαμε. Οι ομάδες που βγαίνουν ανιχνεύονται στα 220nm (απορρόφηση πεπτιδικού δεσμού) σε ανιχνευτή. Λαμβάνω λοιπόν ένα χρωματογράφιμα
Ηλεκτροφόρηση σε πηκτή: Τι είναι, που βασίζεται και ποιά η δράση της πηκτής ;
Οι πρωτεΐνες διαχωρίζονται μέσω πορώδους πηκτής πολυακριλαμιδίου σύμφωνα με το μέγεθός τους με τις μικρότερες να μετακινούνται ταχύτερα προς την άνοδο. Βασίζεται στο ότι ένα μόριο με καθαρό φορτίο κινείται σε ηλεκτρικό πεδίο με ταχύτητα ανάλογη του ηλεκτρικού πεδίου, του καθαρού φορτίου πρωτεΐνης και του συντελεστή τριβής. Η πηκτή χρησιμοποιείται σαν ηθμός για την ενίσχυση του διαχωρισμού λόγω διαφορετικών ταχυτήτων.
Ηλεκτροφόρηση σε πηκτή: που τοποθετούνται οι πρωτεΐνες και πως επιδρά το ρεύμα;
Τα μείγματα των πρωτεϊνών τοποθετούνται σε εσοχές που δημιουργήθηκαν στην άνω πηκτή με τη χρήση πιπέτας ακριβείας μικρολίτρων. Το ρεύμα το οποίο περνώντας μέσα από την πηκτή αναγκάζει το σύμπλοκο πρωτεΐνης-SDS (δωδεκακυλοθειικό νάτριο) που έχει αρνητικό φορτίο να μετακινηθεί προς την άνοδο (θετικό φορτίο) που βρίσκεται στο κάτω μέρος της συσκευής.
Ηλεκτροφόρηση σε πηκτή: Ποιά αντιδραστήρια προστίθενται, ποιος ο στόχος τους και ποιά η σχέση μάζας-φορτίου;
Κάτω από συνθήκες αποδιάταξης οι πρωτεΐνες διαχωρίζονται βάσει της μάζας τους. • Προσθήκη SDS για καταστροφή μη ομοιοπολικών δεσμών (ανοίγουν οι πρωτεΐνες) • Προσθήκη β-μερκαπτοαιθανολη για αναγωγή δισουλφιδικών δεσμών • 1 μόριο SDS ανά 2 αμινοξέα. Σημαντική αύξηση αρνητικού φορτίου – καθαρό φορτίο είναι ανάλογο με την μάζα της πρωτεΐνης (αφού ένα μόριο SDS ανα 2 αμινοξέα).
Ηλεκτροφόρηση σε πηκτή: Τι κάνω όταν λάβω το αποτέλεσμα ;
Όταν πάρω το αποτέλεσμα από την ηλκτροφόρηση μπορώ να κάνω χρώση. Κάνω με κυανούν του Coomassie όπου η πρώτη λωρίδα (στήλη) περιέχει πρωτεΐνες με γνωστά μοριακά βάρη και χρησιμοποιούνται για εκτίμηση μεγέθους των δειγμάτων.
