4η διάλεξη Β μέρος Flashcards
Πως γίνεται η ποσοτικοποίηση του πρωτόκολλου καθαρισμού με χρωματογραφία;
Η ολική πρωτεΐνη σε mg , η ολική δραστικότητα (μονάδες), ειδική δραστικότητα για συγκεκριμένη ομάδα πρωτεϊνών στο μείγμα (μονάδες mg-1 και είναι η ολική δραστικότητα προς την ολική πρωτεΐνη), η απόδοση είναι το κλάσμα της ολικής δραστικότητας που βρέθηκε σε ένα στάδιο προς την ολική δραστικότητα στην αρχή (%). Επίπεδο καθαρισμού, πόσο καθαρή παίρνω την πρωτεΐνη σε κάθε στάδιο (ειδική δραστικότητα κάθε σταδίου/ αρχική).
Ποιο είναι το επιθυμητό αποτέλεσμα σε έναν καθαρισμό και πως ερμηνεύονται οι μπάντες στην χρωματογραφία;
Το επιθυμητό είναι να έχω μεγάλη απόδοση και μεγάλο επίπεδο καθαρισμού αλλά στην πραγματικότητα όσο πιο καθαρή πρωτεΐνη παίρνω τόσο μικρότερη η απόδοση. Στην απεικόνηση όσο πιο έντονη είναι μια γραμμή τόσο πιο καθαρή είναι ενώ όσο πιο φαρδία είναι τόσο περισσότερες προσμίξεις έχει. Άρα θέλω μικρές μπάντες και λίγες.
Τι είναι η φασματομετρία μάζας και τι κάνει ένα φασματόμετρο μάζας;
Αποτελεί τεχνική αναλυτικής χημείας. Βοηθά στην ανίχνευση και ποσοτικό προσδιορισμό χημικών ενώσεων σε ένα δείγμα, μετρώντας τα ιόντα που παράγονται (το πηλίκο m/z). Ένα φασματόμετρο μαζών παράγει ένα φάσμα μάζας χαρακτηριστικό για κάθε συστατικό του μίγματος.
Ποιά η αρχή λειτουργίας της φασματομετρίας μάζας; Με ποια άλλη μέθοδο συνδυάζεται ;
Η αρχή λειτουργίας του στηρίζεται στον ιοντισμό των χημικών ενώσεων(αποκτά φορτίο) και την παραγωγή φορτισμένων μορίων ή θραυσμάτων τους. Δεν είναι τεχνική που λειτουργεί από μόνη της αλλά είναι συζευγμένη με μια τεχνική διαχωρισμού. Έτσι τα διαχωρισμένα μόρια βομβαρδίζονται με δέσμη e- υψηλής Ε ,στην συνέχεια ιοντίζονται και διασπώνται προς πολλά θραύσματα, τα οποία είναι θετικά ή αρνητικά ιόντα ανάλογα με τη μέθοδο.
Δώστε ένα παράδειγμα φασματομετρίας μάζας
Παράδειγμα: για την ένωση CH4+ ο λόγος m/z θα είναι 16,035/1 (Mr/φορτίο μορίου). Κάθε ιόν έχει μια συγκεκριμένη σχέση μάζας προς φορτίο, την τιμή m/z. Για τα περισσότερα ιόντα το φορτίο είναι +1 με αποτέλεσμα η τιμή m/z είναι η μάζα του ιόντος.
Πως γίνεται η φασματομετρία μάζας συγκεκριμένα για τις πρωτεΐνες και πώς γίνεται η μέτρηση του χρόνου ;
Οι διαχωρισμένες πρωτεΐνες ιοντίζονται και επιταχύνονται μέσω ηλεκτρικού πεδίου όπου τα ελαφρύτερα ιόντα φτάνουν πρώτα στον ανιχνευτή. Συγκεκριμένα για τις πρωτεΐνες γίνεται η τεχνική MALDI-TOF όπου η ανάλυση της μάζας γίνεται μέσω της μέτρησης του χρόνου πτήσης των φορτισμένων σωματιδίων μέχρι να φτάσουν τον ανιχνευτή. Η μέτρηση χρόνου γίνεται με την τοποθέτηση του δείγματος σε στερεή μήτρα όπου μια δέσμη λέιζερ κάνει εκρόφηση περνόντας τα ιόντα στην αέρια φάση και παράλληλα ξεκινάει και ο χρόνος μέτρησης πτήσης.
Επίλυση δομής πρωτεΐνών: Τι γνωρίζετε για την κρυσταλλογραφία ακτίνων Χ, ποιά είναι η πηγή ακτίνων και ποιος ο ανιχνευτής ;
Κρυσταλλογραφία ακτίνων Χ: (Κρύσταλλος πρωτεΐνης • Πηγή ακτίνων Χ • Ανιχνευτής): Α. (Συν)κρυστάλλωση (μέγεθος – ποιότητα): όπου οι πρωτεΐνες κρυσταλλόνουν (πλεόν ρομποτικά γιατί πρέπει να γίνει έλεγχος πληθώρας συνθηκών) μέσω της εξαλάτωσης . Η πηγή ακτίνων Χ είτε θα γίνει με πυροβόλο ηλεκτρονίων σε στόχο χαλκού είτε με σύγχροτρο (περιστροφή). Ο ανιχνευτής είτε ακτινογραφικό φίλμ είτε ηλεκτρονιακός ανιχνευτής στερεάς κατάστασης.
Επίλυση δομής πρωτεΐνών: Κρυσταλλογραφία ακτίων Χ : Ποια η διαδικασία και ποιό το αποτέλεσμα ;
Η διαδικασία περιλαμβάνει την δέσμη ακτίνων Χ η οποία περιθλάται από έναν κρύσταλλό και το προκύπτον σχήμα περίθλασης συλλέγεται από έναν ανιχνευτή. Ο κρύσταλλος περιστρέφεται. Το αποτέλεσμα είναι ένα περιθλασίγραμμα που αποτελείται από ένα σύνολο από σημεία. Η λευκή περιοχή ευθύνεται στο εμπόδιο που προστατύει τον ανιχνευτή από την κύρια δέσμη (μη σκεδασμένες). Από την ένταση την θέση και την γεωμετρία των σημείων παίρνω τα πειραματικά δεδομένα.
Επίλυση δομής πρωτεΐνών: Κρυσταλλογραφία ακτίων Χ: Τι γνωρίζετε για την αποσύνθεση της εικόνας του χάρτη που προκύπτει και τι για την διακριτική ικανότητα; Πότε είναι βέλτιστη ; Από τι εξαρτάται το πλήθος των σημείων ;
Έτσι λαμβάνεται ένας χάρτης ηλεκτρονιακής πυκνότητας (3D) με ισοϋψείς (ίδια ένταση) γραμμές και οι περιοχές που σχηματίζονται είναι αυτές με την μεγαλύτερη ηλεκτρονιακή πυκνότητα (πυρήνας). Έτσι επάνω στον χάρτη χτίζεται ένα προσμομοίωμα της πρωτεΐνης και τα άτομα τοποθετούνται εκεί που η πυκνότητα είναι έντονη. Η διακριτική ικανότητα έχει να κάνει με την ποιότητα της ανασύστασης μιας εικόνας. Εξαρτάται από το πόσα σημεία από την περίθλαση θα χρησιμοποιηθούν. Επίσης το πλήθος των σημείων εξαρτάται και από την τεχνική μου (ποιότητα κρυστάλλου, ένταση πηγής). Η καλύτερη είναι όταν έχω μικρότερο επίπεδο διακριτικής ικανότητας (μεγαλύτερη λεπτομέρεια)
Τι είναι η Φασματοσκοπία Πυρηνικού Μαγνητικού Συντονισμού NMR και τι σημαίνουν οι όροι ;
Φαινόμενο κατά το οποίο οι πυρήνες ατόμων με αυτοστροφορμή (spin) υπό την επίδραση ισχυρού στατικού μαγνητικού πεδίου, όταν ακτινοβολούνται διεγείρονται και κατά την αποδιέγερσή τους δίνουν σήμα. (αφορά τους πυρήνες και όχι τα e-).
Ανάλυση όρων:• Πυρηνικός: Ανίχνευση πυρήνων με spin (στροφορμή). • Μαγνητικός: Λήψη φασμάτων εντός μαγνητικού πεδίου. • Συντονισμός: Οι πυρήνες διεγείρονται με την εκπομπή παλμών υψηλής συχνότητας προς το δείγμα και κατά την αποδιέγερση λαμβάνεται και καταγράφεται το σήμα. Δεν μπορούν όλα τα στοιχεία να μας δώσουν NMR γιατί δεν έχουν οι πυρήνες τους spin.
Ποια η αρχή λειτουργία του NMR
Οι πυρήνες που περιστρέφονται σχηματίζουν μαγνητικό πεδίο ανάλογο του spin τους. Κάποιοι από τους πυρήνες θα διευθετηθούν παράλληλα και κάποιοι αντιπαράλληλα στην φορά της εφαρμογής του εξωτερικού μαγνητικού πεδίου. Τα παράλληλα έχουν χαμηλή ενώ τα αντιπαράλληλα έχουν υψηλότερη Ε. Για να μεταπτώσει ένας πληθυσμός πυρηνών από την χαμηλότερη στην υψηλότερη Ε πρέπει να δεχτεί Ε από ακτινοβολία. Άρα συντονίζω τους παράλληλους πυρήνες για να γίνουν αντιπαράλληλοι. Στην παύση του συντονισμού από την ακτινοβολία επανέρχονται στην αρχική τους θέση και μας δίνουν ένα σήμα που καταγράφεται ώς φάσμα NMR. Στο φάσμα NMR μιας πρωτεΐνης λαμβάνω πολλές κορυφές εκ των οποίων πολλές αλληλεπικαλύπτονται.
Τι πληροφορία παίρνουμε που μας ενδιαφέρει απο την NMR σχετικά με τις πρωτεΐνες και τα αμινοξέα ;
Η πληροφορία που μας ενδιαφέρει είναι το πυρηνικό φαινόμενο Overhauser το οποίο ταυτοποιεί ζεύγη πρωτονίων που βρίσκονται το ένα κοντά στο άλλο. Άρα ότι τα Η ενός αμινοξέως αλληλοεπιδρούν με τα Η ενός άλλου αμινοξέως. Αναπαρίσταται σε ένα διάγραμμα δύο διαστάσεων (χημική μετατόπιση πρωτονίων/ χημική μετατόπιση πρωτονίων). Το ότι αλληλεπιδρούν σημαίνει ότι στον χώρο βρίσκονται σε απόσταση <5Å. Έτσι μπορώ να λάβω πολλές πληροφορίες για την αλληλεπίδραση των Η και να δώ πως είναι διευθετημένη η πρωτεΐνη στον χώρο. Άρα οποιαδήποτε κουκίδα στο διάγραμμα NOESY μου δείχνει την αλληλεπίδραση μεταξύ τους.
Ποιά η διαφορά της NMR απο την κρυσταλλογραφία ;
Η διαφορά της με την κρυσταλλογραφία είναι οι βρίσκεται σε διάλυμα η πρωτεΐνη , άρα βρίσκεται σε δυναμική φύση. Άρα στο NMR δεν παίρνω μια συγκεκριμένη διάταξη στον χώρο (κρυσταλλογραφία) αλλά μια οικογένεια δομών, επειδή οι περιοριστικές αποστάσεις δεν είναι αρκετές, η ποσοτικοποίηση των σημάτων γίνεται με εκτίμηση (απόκλιση). Στο δείγμα επίσης βρίσκονται πολλά μόρια με μικρές διαφορές στην δομή τους. Άρα παίρνω την οικογένεια δομών και βγάζω τον μέσο όρο.
