Κεφάλαιο 4 Flashcards
Τι είναι οι περιοριστικές ενδονουκλεάσες?
Ενζύμα που κόβουν το DNA σε κομμάτια με συγκεκριμένη αλληλουχία βάσεων.
Τι βοήθησε στην ανάπτυξη της τεχνολογίας του ανασυνδιασμένου DNA?
Η απομόνωση και χρήση πολυάριθμων ενζύμων, έδωσε στους ερευνητές τη δυνατότητα «αναπαραγωγής» των διαδικασιών της αντιγραφής, αντίστροφης μεταγραφής, μεταγραφής και μετάφρασης in vitro.
Ειδικότερα η απομόνωση των περιοριστικών ενδονουκλεασών και των ειδικών φορέων που μεταφέρουν DNA από κύτταρο σε κύτταρο.
Τι ονομάζουμε ανασυνδιασμένο μόριο DNA?
Τεχνητό μόριο DNA που περιέχει γονίδια από δύο η περισσότερους οργανισμούς.
Που μπορεί να εισαχθεί ενα τεχνητό μόριο DNA?
Σε ένα βακτήριο ή σε ένα ευκαριωτικό κύτταρο. Τα γενετικά τροποποιημένα βακτήρια ή κύτταρα είναι ικανά να ζούν και να αναπαράγονται μεταφέροντας στους απογόνους τους τις καινούργιες ιδιότητες.
Τι ονομάζουμε Γενετική Μηχανική?
Τεχνικές με τις οποίες ο άνθρωπος επεμβαίνει στο γενετικό υλικό.
Που βοήθησε η Γενετική Μηχανική?
α. Στην κατανόηση των μυστηρίων της ζωής και της εξέλιξης πάνω στη Γη
β. Στη βελτίωση της υγείας και του τρόπου διαβίωσης του ανθρώπου.
Τι περιλαμβάνει η τεχνολογία του ανασυνδιασμένου DNA?
Περιλαμβάνει όλες τις τεχνικές που οδηγούν σε μεταφορά του γενετικού υλικού από τον ένα οργανισμό στον άλλο
Πως μεταφέρουμε το γενετικό υλικό ενός οργανισμού σε έναν άλλο οργανισμό?
I) Tο ολικό DNA από έναν οργανισμό δότη απομονώνεται, κόβεται ενζυμικά με τις περιοριστικές ενδονουκλεάσες, και ενώνεται με ένα φορέα κλωνοποίησης.
ΙΙ) Μεταφέρουμε το ανασυνδυασμένο μορίου DNA σε ένα κύτταρο-ξενιστή.
ΙΙΙ) Επιλέγουμε και απομονόνουμε τα κυττάρα-ξενιστες. Στο στάδιο αυτό τα κύτταρα-ξενιστές που έχουν προσλάβει το ανασυνδυασμένο DNA επιλέγονται από εκείνα που δεν το έχουν προσλάβει. Κάθε βακτήριο που προσλαμβάνει ένα μόνο μόριο ανασυνδυασμένου DNA πολλαπλασιάζεται και παράγει μια αποικία που αποτελεί ένα βακτηριακό κλώνο.
ΙV) Επιλέγουμε έναν βακτηριακό κλώνο που περιέχει το επιθυμητό τμήμα DNA. Αυτο πραγματοποιείται με τη βοήθεια ειδικών μορίων ανιχνευτών.
Τι είναι ο φορέας κλωνοποίησης?
Ο φορέας κλωνοποίησης είναι ένα μόριο DNA, (πλασμίδιο ή DNA φάγων), το οποίο μπορεί να αυτοδιπλασιάζεται ανεξάρτητα μέσα σε ένα κύτταρο-ξενιστή όπως ένα βακτήριο.
Τι ονομάζουμε μετασχηματισμό?
Μετασχηματισμό ονομάζουμε την εισαγωγή του DNA σε βακτηριακό κύτταρο-ξενιστή.
Τι ονομάζουμε κλώνο?
Ο όρος κλώνος αναφέρεται σε μια ομάδα πανομοιότυπων μορίων, κυττάρων, ή οργανισμών.
Τι ονομάζουμε κλωνοποίηση?
Ο όρος κλωνοποίηση αναφέρεται στην κατασκευή, κατά προτίμηση μεγάλου αριθμού, πανομοιότυπων μορίων, κυττάρων ή οργανισμών.
Ποιός είναι ο φυσιολογικός ρόλος των περιοριστικών ενδονουκλεάσεων?
Οι περιοριστικές ενδονουκλεάσες παράγονται από βακτήρια και ο φυσιολογικός τους ρόλος είναι να τα προστατεύουν από την εισβολή «ξένου» DNA. Οι περιοριστικές ενδονουκλεάσες αναγνωρίζουν ειδικές αλληλουχίες 4-8 νουκλεοτιδίων στο δίκλωνο DNA.
Αναφέρετε γνωρίσματα της περιοριστικής ενδονουκλεάσης EcoRI.
Η EcoRI που απομονώθηκε από το βακτήριο Escherichia coli. Το ένζυμο αυτό όποτε συναντά την αλληλουχία:
5’-G Α Α Τ Τ C-3’
3’-C Τ Τ A A G-5’ στο γονιδίωμα, κόβει κάθε αλυσίδα μεταξύ του G και του Α (με κατεύθυνση 5’→3’) αφήνοντας μονόκλωνα άκρα από αζευγάρωτες βάσεις στα κομμένα άκρα.
Πως μπορούν να χρησιμοποιηθούν τα μονόκλωνα άκρα τα οποία έχουν κοπεί ενζυμικά από περιοριστικές ενδονουκλεάσες?
Τα άκρα αυτά μπορούν να σχηματίσουν δεσμούς υδρογόνου με τις συμπληρωματικές βάσεις άλλων κομματιών DNA που έχουν κοπεί με την ίδια περιοριστική ενδονουκλεάση.
Τι ονομάζουμε γονιδιωματική βιβλιοθήκη?
Το σύνολο των βακτηριακών κλώνων περιέχει το συνολικό DNA ενός οργανισμού δότη.
Αναφέρετε τα στάδια κατασκευής γονιδιωματικής βιβλιοθήκης με την χρήση της EcoRI.
1) Απομονώνουμε DNA από οργανισμό δότη όπου η αλληλουχία GAATTC υπάρχει διάσπαρτη στα γονιδιώμά του.
Το γονιδίωμα του οργανισμού δότη κόβεται ενζυμικά απο την EcoRI σε χιλιάδες κομμάτια.
2)Κόβουμε ενζυμικά με την EcoRI πλασμίδια (φορέας κλωνοποίησης)όπου έχουν τη συγκεκριμένη αλληλουχία μία μόνο φορά δημιουργόντας έτσι ένα γραμμικό μόριο DNA με μονόκλωνα άκρα. 3)Αναμιγνύουμαι τα δύο είδη DNA, του πλασμιδίου και του οργανισμού και επειδή έχουν συμπληρωματικά άκρα, ενώνονται μεταξύ τους με τη μεσολάβηση της DNA δεσμάσης.
4)Στο στάδιο αυτό δημιουργούνται ανασυνδυασμένα πλασμίδια. Μερικά πλασμίδια ξαναγίνονται κυκλικά, χωρίς να προσλάβουν κόμματι γονιδιώματος του οργανισμού.
5)Σε αυτό το στάδιο μεταφέρουμε τα ανασυνδιασμένα πλασμίδια σε βακτήρια - ξενιστές. Ως ξενιστές χρησιμοποιούνται βακτήρια που δεν έχουν πλασμίδια διότι είναι ευαίσθητα σε αντιβιοτικά. Για να μπει ένα πλασμίδιο μέσα στο βακτήριο, τα τοιχώματα του βακτηρίου γίνονται παροδικά διαπερατά σε μακρομόρια, μετά από κατάλληλη κατεργασία.
6)Σε αυτό το στάδιο επιλέγουμε τα βακτήρια που δέχτηκαν ανασυνδυασμένο πλασμίδιο. Η επιλογή στηρίζεται στην ικανότητα ανάπτυξής τους παρουσία αντιβιοτικού (το ανασυνδυασμένο πλασμίδιο περιέχει ένα γονίδιο ανθεκτικότητας στο αντιβιοτικό). 7)Τοποθετούμε τα βακτήρια σε θρεπτικό υλικό και σε ευνοικές για αυτά συνθήκες πολλαπλασιάσμου μας δίνουν ένα κλώνο.Το σύνολο των κλώνων αυτών που περιέχουν το συνολικό DNA του οργανισμού δότη ονομάζεται γονιδιωματική βιβλιοθήκη.
Σε τι χρησιμεύουν οι ανιχνευτές?
Στην επιλογή ενός κλώνου που περιέχει ένα επιθυμητό γονίδιο.
Ποιά είναι η διαφορά του βακτηριακού φάγου λ από τα πλασμίδια?
Ο βακτηριοφάγος λ μπορεί να ενσωματώσει μεγαλύτερα κομμάτια DNA δότη.
Σε ποιά περίπτωση κατασκευάζουμε cDNA βιβλιοθήκες?
Όταν θέλουμε να κλωνοποιήσουμε μόνο τα γονίδια που εκφράζονται σε συγκεκριμένα κύτταρα.
Τι είναι οι cDNA βιβλιοθήκες?
Οι cDNA βιβλιοθήκες περιέχουν αντίγραφα των mRNA όλων των γονιδίων που εκφράζονται στα κύτταρα που περιέχουν τα γονίδια που θέλουμε να κλωνοποιήσουμε. Οι cDNA βιβλιοθήκες έχουν το πλεονέκτημα απομόνωσης των εξωνίων.
Πως κατασκευάζεται μια cDNΑ βιβλιοθήκη?
1)Απομονώνουμε το ολικό «ώριμο» mRNA από κύτταρα που εκφράζουν το επιθυμητό γονίδιο.
2)Χρησιμοποιούμε τo mRNA σαν καλούπι για τη σύνθεση μιας συμπληρωματικής αλυσίδας DNA με την παρουσία ενζύμου αντίστροφη μεταγραφάση. Έτσι παράγονται υβριδικά μόρια cDNA-mRNA. 3)Αποδιατάσουμε το υβριδικό μόριο cDNA-mRNA με θέρμανση ή προσθέτουμε κατάλληλες χημικές ουσίες για την διάσπασή του.
4)Προσθέτουμε το ένζυμο DNA πολυμεράση για την κατασκευή συμπληρωματικών αλυσιδών με καλούπι την αλυσίδα cDNA.
5)Τα δίκλωνα μόρια DNA εισάγονται σε πλασμίδια ή βακτηριοφάγους και κλωνοποιούνται με τη διαδικασία του μετασχηματισμού και της καλλιέργειας.
6
Σε τι αποσκοπεί η κατασκευή cDNA βιβλιοθήκης?
Όταν θέλουμε να κλωνοποιήσουμε μόνο τα γονίδια που εκφράζονται σε συγκεκριμένα γονίδια. Το κλωνοποιήμενο μόριο cDNA μπορεί να κατευθύνει την σύνθεση μιας ειδικής πρωτείνης του συγκεκριμένου γονιδίου μεσα στο κύτταρο ξενιστή.
Τι ονομάζουμε αποδιάταξη?
Αποδιάταξη είναι ο διαχωρισμός των δύο συμπληρωματικών αλισιδών του DNA είτε με την χρηση κατάλληλων χημικών ουσιών, είτε με θέρμανση. Και στις 2 περιπτώσεις σπάνε οι δεσμοί υδρογόνου που αναπτύσσονται μεταξύ των αζωτούχων βάσεων.
