31.03.23 Flashcards
Welche Aussagen treffen auf eine elektrochemische Zelle bestehend aus einem Platin-Stab in Platinionenlösung (Pt²⁺/Pt, +1,18 V) und einem Silber-Stab in Silberionenlösung (Ag⁺/Ag, +0,80 V) zu?
A. Pt(0) → Pt²⁺ + 2e⁻
B. Ag(0) → Ag⁺ + e⁻
C. Ag⁺ + e⁻ → Ag(0)
D. Pt²⁺ + 2e⁻ → Pt(0)
E. Der Platin-Stab ist die Kathode
F. Der Silber-Stab ist die Anode
G. An der Kathode findet eine Oxidation statt
H. An der Kathode findet eine Reduktion statt
B,D,E,F,H
EB: das was Stärker + geladen ist nimm lieber Elektronen auf und wird dabei Reduziert “Pt”, das was weniger positiv geladen ist gibt lieber Elektronen ab und wird dabei Oxidert “Ag”
Anode A–> minus - gleich negativer geladene Metall = Zn
OxidAtion = Anode
ReduKtion= Kathode
Welche Methoden der Proteinbestimmung sind subjektiv?
A. Biuret
B. Lowry
C. BCA
D. Bradford
E. Absorption bei 280nm
F. Absorption bei 205nm
G. Fluoreszenz
H. Affinitätschromatographie
Korrekt: D,E,G
Subjektiv: Bradford, UV-Absorption A280nm aromatisch AS, Fluoreszenz (nur Trp)
Objektiv: Biuret, Lowry, Bicinchoninsäure (BCA), UV-Absorption A205nm Peptidbindung
Subjektiv ist alles was mit einer Seitenkette einer AS reagiert
Objektiv ist alles was das Peptidbackbone betrachtet
………………………………………..
Affinitätschromatographie : Weder objektiv noch subjektiv ist keine Proteinquantifizierungsverfahren im klassischen Sinn, sondern eine selektive Aufreinigungstechnik
Molekül/ Tripeptid gezeichnet gewesen, wie viel Spinsysteme enthält diese Struktur ?
A. 1
B. 2
C. 3
D. 4
E. 5
C.3
Das Molekül enthält 3 Spinsysteme.
🟢 Je eins pro Aminosäure-Seitenkette:
Serin-Seitenkette (CH₂OH)
Cystein-Seitenkette (CH₂SH)
Valin-Seitenkette (CH–(CH₃)₂)
Welche Fragmentierungstechnik(en) verwendet man, wenn PTMs (posttranslationale Modifikationen) erhalten bleiben sollen.
A. ETD (Electron Transfer Dissociation)
B. ECD (Electron Capture Dissociation)
C. EDD (Electron detachment Dissoziation)
D. CID (Collision Induced Dissociation)
E. HCD (Higher-energy Collisional Dissociation)
F. IRMPD (Infrared Multiphoton Dissociation)
Fragemntierungstechnicken damit PTMs erhalten beleiben (ESI-MS):
* ETD (Electron Transfer Dissociation)
* ECD (Electron Capture Dissociation)
* EDD (Electron detachment Dissoziation)
…………………………………
*Bleibt NICHT erhalten bei…… (dort werden diese Bindungen meist zersört)
CID (Collision Induced Dissociation)
HCD (Higher-energy Collisional Dissociation)
IRMPD (Infrared Multiphoton Dissociation)
Welche Arbeitsschritte kommen typischerweise in einem Proteomics-Workflow vor?
A ELISA
B. NMR
C. Edman-Abbau
D. SEQUEST
E. Isotopenmarkierung
F. LC-MS/MS
G. ETD
H. ECO
I. Pertubationsanalyse
……………………………………………………
MC Prtoeom ohne gel 30.09.24
Gel Basiert:
D. SEQUEST
F. LC-MS/MS
I. Pertubationsanalyse
Nicht Gel basiert:
D. SEQUEST
E. Isotopenmarkierung
F. LC-MS/MS
G. ETD
I. Pertubationsanalyse
Einstabmesskette gezeichnet gewesen —> diese beschriften; Funktionsweise erklären, Wie funktioniert die ph-Wert-Messung damit ?
Methode der Direkpotentiometrie
Die Einstabmesskette vereint eine pH-sensitive Glaselektrode (Indikator Elektrode) mit einer Referenzelektrode (z. B. Ag/AgCl) in einem Gehäuse – kompakt und einfach in der Handhabung.
Beim Eintauchen in die Lösung entsteht an der Glasmembran eine Potentialdifferenz, die vom [H⁺]-Gehalt der Probe abhängt (also vom pH). Diese Spannung wird gegen die Referenzelektrode gemessen und folgt der Nernst-Gleichung.
Der pH-Wert wird so direkt und kontinuierlich bestimmt.
Erklären Sie das Prinzip der Isothermen Titrationskaloriemtrie.
Welche Kenngrößen können bestimmt werden?
Nennen Sie ein Anwendungsbeispiel.
Nennen Sie 2 weitere Methoden nennen, die das gleiche analysieren
-
Kenngrößen:
Die ITC ist eine quantitative Messmethode zur Messung von Bindungsaffinität Ka, Bindungsenthalpie (ΔH), Bindungsstöchiometrie (n) und daraus abgeleitet ΔG und ΔS. -
Prinzip:
Sie ist aufgebaut aus einer Probe- und einer Referenzzelle, die beide die gleiche Temperatur haben. Die Zugabe von einem Liganden bewirkt eine Aufnahme oder Abgabe von Wärme. Die Energie, die benötigt wird um beide Zellen wieder auf die gleiche Temperatur (Isotherm) zu bringen, wird gemessen. -
Anwendung:
wird verwendet um die Bindungsvorgänge zweier Partner in Lösung zu messen, z.B. die Bindung kleiner Moleküle, wie z.B.: WSt, an größere Makromolekülel, wie DNA oder Proteine. - Methoden die das gleiche analysieren: Bindungsaffinität
–>Radioimmunassay,Elisa, Biocore-Technik, SPR(surface plasmon resonance)
Erklären Sie die N-Terminale Leitersequenzierung, Was ist der grundsätzliche Unterschied zur de-novo-Sequenzierung, Wo sind die Grenzen der beiden Methoden?
N-terminale Leitersequenzierung:
* unvollständiger Edman-Abbau wird verwendet ( 5min statt 30min).
* Dabei entsteht ein Peptid-Gemisch, das jeweils um eine AS verkürzt ist („Peptidleiter“).
* Gemisch mit MALDI-TOF-MS analysiert
* Aus den Massenunterschieden der einzelnen Signale im Spektrum kann die Aminosäuresequenz ermittelt werden.
* Nachteil/Grenzen: keine Unterscheidung von Leucin und Isoleucin, nur für Peptide mit freiem N-Terminus geeignet, gut bis ca. 5 kDa
De-novo-Sequenzierung: –>für N-terminal blockierte Proteine geeignet
* Protein zunächst enzymatisch (z. B. mit Trypsin) in Peptide gespalten.
* Messung mittels Tandem-MS (z. B. ESI-MS/MS mit CID)
* Diese werden im MS isoliert und gezielt fragmentiert.
* Die entstehenden b- und y-Ionen werden analysiert, und aus ihren Massendifferenzen wird die AS-sequenz rekonstruiert – unabhängig vom N-Terminus.
* Nachteil/Grenzen kein Unterschied zwischen Leu/Ile, Fragmentgröße bis ca. 7 kDa
- Erklären Sie das Prinzip der Gelchromatographie im Vergleich zur Gelelektrophorese. Was ist bei beiden Methoden gemeinsam und was unterschieldich?
- prinzip gelchromatographie an beispiel
✅ Gelchromatographie – Prinzip:
auch Größenausschlusschromatographie, GPC/SEC) ist ein Verfahren zur Trennung von Molekülen nach ihrer Größe (hydrodynamischem Volumen).
Die Probe wird über eine Säule mit porösem Gelmaterial (z. B. Sephadex, Polyacrylamid) gegeben.
* Große Moleküle können nicht in die Poren eindringen → sie werden schneller eluieren.
* Kleine Moleküle treten in die Poren ein → haben einen längeren Weg → eluieren später.
→ Es entsteht eine größenbasierte Trennung: große zuerst, kleine zuletzt
* Fragestellung Man möchte Gemisch aus Proteinten unterschiedlicher größe 50kDa 150kDa voneinander trennen ? Die Proteine kommen also gestaffelt nach Größe aus der Säule: groß → mittel → klein
✅ Gelelektrophorese – Prinzip:
Methode zur Trennung von Molekülen (v. a. Proteinen oder DNA) in einer Gelmatrix unter Einfluss eines elektrischen Feldes.
* Moleküle mit elektrischer Ladung wandern im Gel zur entgegengesetzten Elektrode:
Die Gelmatrix (z. B. Polyacrylamid oder Agarose) wirkt wie ein molekulares Sieb:
→ kleine Moleküle bewegen sich weiter/schneller,
→ große Moleküle werden stärker abgebremst/ kürzer Laufweg
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Gemeinsamkeiten:
* Beide Methoden nutzen eine Gelmatrix
* Trennung erfolgt in beiden Fällen auf Basis der Größe bzw Molekülmasse
* Einsatz v. a. bei Proteinen, Peptiden oder Nukleinsäuren.
Unterschiede:
* Gelchromatographie trennt nach Größe bwz Permeation, ohne elektrische Ladung.
* Gelelektrophorese trennt nach Größe und/oder Ladung, im elektrischen Feld
Welche Fraktonierung kann für ca. 500 AS lange Peptidkette angewendet werden. Fraktionierung detailliert beschreiben. Wie bestimmt man die Konzentration von Proteinen in einer wässrigen Lösung?
die frage würd ich eher spritzen
✅ Gelchromatographie – Prinzip:
auch Größenausschlusschromatographie, GPC/SEC) ist ein Verfahren zur Trennung von Molekülen nach ihrer Größe (hydrodynamischem Volumen).
Die Probe wird über eine Säule mit porösem Gelmaterial (z. B. Sephadex, Polyacrylamid) gegeben.
* Große Moleküle können nicht in die Poren eindringen → sie werden schneller eluieren.
* Kleine Moleküle treten in die Poren ein → haben einen längeren Weg → eluieren später.
→ Es entsteht eine größenbasierte Trennung: große zuerst, kleine zuletzt
* Fragestellung Man möchte Gemisch aus Proteinten unterschiedlicher größe 50kDa 150kDa voneinander trennen ? Die Proteine kommen also gestaffelt nach Größe aus der Säule: groß → mittel → klein
* Alternativ bzw. ergänzend kann auch eine Ionenaustauschchromatographie (IEC) verwendet werden, wenn man die Ladungseigenschaften der Peptidkette ausnutzen will.
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Bestimmung der Proteinkonzentration in wässriger Lösung:
* In wässriger Lösung mittels Gefriertrocknung und Gewichtsbestimmung bzw Aminosäureanalyse Farbreaktionen oder Spektroskopische Methoden
* Biuret (Kuper 2 Ionen werden durch Peptidbindungen koordiniert- rotviolett) =Rkt mit Kupfersulfat im alkalischen,wässrigen Mileu
* Lowrey: Biuret+Folin-cioclateau-Reagenz (->Kupfer-Protein-Komplex) blau
* Bichinionsäure: Biuret-Reagenz +BCA (Reduktion von Cu2+ zu Cu+)
* Bradford: Kein Kupfer, Coomassi-Brillantblau wird verwendet (empfindlichster Test)
* UV-Absorption (A280= arom AS, A205=Peptidbdg) und Floureszenz (eigenfluoreszenz v Tryptophan)
Was ist der Elektroosmotische Fluss und wofür wird er eingesetzt? Was ist der isoelektrische Punkt?
die frage würd ich eher spritzen
- Wichtigstes Transportphänomen in allen elektrophoretischen Trennprozessen, das immer dann auftritt, wenn an ein flüssiges System, das in Kontakt mit einer geladenen festen Oberfläche steht und eine Spannung angelegt wird.
- Vor allem für Kapillarelektrophorese wichtig, beschleunigt Ionen oder bremst diese ab (je nach Ladung) somit kommt es zu einer Trennleistung.-> Bei CE sind Kationen schneller als Anionen
b. Was ist der isoelektrische Punkt?
* Der pH-Bereich an dem die Nettoladung einer Aminosäure bzw Proteins Null ist, Wasserlöslichkeit ist hier am geringsten
Erklären Sie wie NMR-Spektroskopie funktioniert bzw. das Prinzip, was kann dabei bestimmt werden und wie wird es bestimmt ?
Prinzip der NMR-Spektroskopie (bei Proteinen):
Die NMR-Spektroskopie misst die Resonanz von Atomkernen mit Spin ≠ 0 (z. B. ¹H, ¹³C, ¹⁵N) in einem starken Magnetfeld.
Durch Radiowellen-Pulse werden diese Kerne angeregt, und aus dem Rücksignal (FID) werden chemische Verschiebungen, Kopplungen, Abstände und Winkel berechnet.
Was wird bestimmt?
* Chemische Verschiebung (δ): Info über chemische Umgebung der Kerne
* Kopplungskonstanten (J): Gibt Bindungsverhältnisse zwischen Nachbarkernen an
* NOE-Signale (NOESY): Abstände zwischen Kernen von H-Kernen (bis ~5 Å)
* Torsionswinkel (z. B. φ, ψ): über Karplus-Beziehung ableitbar → Rückgrat-Geometrie
→ Daraus + mehrdimensionaler NMR (z. B. COSY, TOCSY, NOESY) lässt sich die dreidimensionale Tertiärstruktur eines Proteins in Lösung rekonstruieren – einschließlich Informationen über Proteinfaltung Konformation, Dynamik und molekulare Interaktionen. –> WSt entwicklung
