10.04.24 Flashcards
Mit Welcher Methode kann man Proteine faktionieren ?
Welche Verfahren können preparativ zur Fraktionierung von Proteingemsichen verwendet werden?
A. Affinitätschromatographie
B. lonenaustauschchromatographie
C. SDS-PAGE
D. Adsorptionschromatographie
E. lEF
MC Frage aus VO
Korrekte Anwort:
* B. lonenaustauschchromatographie
* D. Adsorptionschromatographie
* E. lEF (Isoelektrische Fokussierung)
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Affinitätschhromatographie:
—> Ist prinzipiell extrem gut um ein Protein zu isolieren ein ganz bestimmtes aber nicht um ein Proteingemisch aufzutrennen zu mehreren Fraktionen.
Ionenaustauschchromatographie:
Kann man verwenden um Präperativ große Mengen Proteine aufzutrennen in mehrere Fraktionen.
SDS-PAGE:
Wird nur Analytisch eingesetzt
Adsorptionschromatographie:
Damit kann man auch Proteine auftrennen
IEF Isoelektrische Fokussierung:
Damit kann man auch Proteine auftrennen
Edman Abbau - was stimmt:
A. für N unsubstituiert
B. für N substituiert
C. für Proteine kleiner als 4kDa
D. für Proteine kleiner als 7kDa
Korrekte Antwort: A. für N unsubstituiert.
Ganze Reaktionskaskade vom Edman-Abbau funktioniert nur wenn der N-Terminus frei ist, das trifft aber nur auf 50% aller Proteine zu,
1. N-Terminus muss frei sein NH2—
2. Bruchstücke / Peptide mit max. Länge von 40-60AS
……………………………………………………………………………….
* Edmann-Abbau: N-terminal unmodifizierte R–NH2 , 40-60AS
-
Massenspektrometrie MS: N-Terminus egal, 7kDa Größen Limit
1) Maldi + N-Termin Leitersequenzierung, geht gut bist 5kDa danach zu komplex, R—NH2 Edman-basierte MALDI-Leitersequenzierung braucht freien N-Terminus.
2) PSD- Maldi —> 2kDa, N-Terminus-Egal
-
ESI Tandem- MS MS/MS Ms^2/MS^n. n=2-10
DeNovo Sequenzierung
Effektive Migrationsgeschwindigkeit:
A. abhängig von EOF
B. unabhängig von EOF
C. ist immer kleiner/größer als y(theo)
D. kann negativ sein (?)
Korrtekt:
* A. abhängig von EOF
Die effektive Migrationsgeschwindigkeit ist die Summe aus elektrophoretischer Mobilität + EOF.
* D. kann negativ sein
Wenn z. B. ein stark negativ geladenes Ion gegen den EOF läuft und dessen Eigenmobilität größer als der EOF ist, kann die effektive Geschwindigkeit negativ sein → d. h. es wandert zur Anode.
………………………………………………….
Falsch:
* B. unabhängig vom EOF
Gerade der EOF bestimmt maßgeblich, ob ein Ion schneller wandert, zurückgehalten wird oder sogar die Richtung wechselt.
* C. Die effektive Migrationsgeschwindigkeit ist immer größer als die theoretische. ( aus VO online)
Nein, Sie kann größer, kleiner oder sogar negativ sein – je nach Ladung und EOF-Richtung.
- Radioimmunoassay erklären und Anwendung
- Erklären Sie kurz das Prinzip des Radioimmunoassay? Nennen Sie ein
Einsatzgebiet! Was wäre eine alternative Methode, die ohne Radioaktivität auskommt?
Der Radioimmunoassay (RIA) ist ein kompetitiver Immunoassay, bei dem ein “heißes” radioaktiv markiertes Antigen (¹²⁵Iodid) bekannte Menge mit dem unmarkierten “kaltes” Antigen unbekannte Menge aus der Probe um die Bindung an spezifische Antikörper konkurriert.
Die Menge an gebundenem radioaktivem Antigen ist umgekehrt proportional zur Antigenkonzentration in der Probe lässt sich mittels Kalibrationskurve quantifizieren.
Einsatzgebiet:
→ Bestimmung von niedrig konz. Plasmabestandteile wie Hormonen (z.B Schilddrüsenprobleme), Interleukinen oder Drugs verwendet.
Alternative Methode ohne Radioaktivität:
→ ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay
- Diagramm von CD gegeben- achsen und kurven beschriften und CD erklären
- Erklären Sie kurz, wie die Sekundärstruktur von Proteinen mittels Circulardichroismus bestimmt werden kann. Nennen Sie 3 Beispiele für Fragestellungen, die mittels CDSpektroskopie beantwortet werden können.
- Circulardichroismus (CD) misst die Differenz der Absorption von links- und rechtszirkular polarisiertem Licht durch chirale Moleküle (v. a. Peptidbindungen).
- Circular polarisiertes Licht besteht aus 2 Linear polarisierten Wellen, die um 90° phasenverschoben sind. –> E1 vor E2 rechts polarisiertes Licht & E2 vor E1 links polarisiertes Licht.
Sekundärstrukturen wie α-Helix, β-Faltblatt und Random Coilzeigen charakteristische CD-Spektren im fernen UV-Bereich (190–250 nm).
Durch Vergleich mit Referenzspektren kann der Sekundärstrukturgehalt eines Proteins bestimmt werden.
* 170-250nm = Amidregion
* 250-300nm= aromatische Region
* 250nm= Disulfidbrücken
* CD-Diagramm: x-Achse: Wellenlänge [nm] & y-Achse: mean residue weight MRW [θ] oder Δε
- Fragestellungen:
–> Wie hoch ist der Anteil an Disulfidbrücken
–> Wie hoch ist der Anteil an welchen Sekundärstrukturelementen ( z.B α-Helix)
–> Tritt eine Konformationsänderung bei veränderten Bedingungen (z. B. pH, Temperatur, Ligand) auf ?
- NMR frage cosy tocsy usw, was ist sequential walk, Karplus beziehung
- 2D-NMR COSY/TOCSY/ROESY
a. Was für NMR Spektren bekommt man, und welche Aussagen können getroffen werden? was ist sequential walk
b. Was ist Karplus-Beziehung?
- COSY (Correlation Spectroscopy):
→ zeigt geminale (2 Bindungen) und vicinale (3 Bindungen) H-H-Kopplungen
→ Aufklärung der Spin-Spin-Kopplung, Zuordnung benachbarter Protonen
→ Kreuzsignale: Kopplungspartner, Diagonal: eigenes Signal - TOCSY (Total Correlation Spectroscopy):
→ Magnetisierungstransfer entlang eines ganzen Spinsystems
→ kontinuierliche Kette von Protonen die an benachbarten Kerne gebunden sind, z.B jede AS eines Proteins
→ Es werden Kreuzsignale für alle Protoenen innerhalb einr AS oder eines Moleküls gezeigt - NOESY & ROESY (Nuclear/Rotating Overhauser Effect Spectroscopy):
→ zeigt Kopplung durch den Raum (nicht über Bindungen), < 5 Å Abstand
→ verbindet verschiedene Spinsysteme (aus COSY & TOCSY) → in der Richtigen Reihenfolge
→ entscheidend für Strukturbestimmung von Proteinen
Also Short:
→COSY: zuordnung der einzelnen Signale z jeweiligen Protonen
→TOCSY: identifizieren der einzelnen Spinsysteme (= AS)
→NOESY: ‘sequental walk” - , man bewegt sich anhand von
NOESY Kreuzsignalen von einer As zur nächsten &ordnet so die signale zu.
………………………………………………………………….
Karplus-Beziehung:
Beschreibt die Korrelation zwischen der vicinalen Kopplungskonstante (³J) und dem Diederwinkel (Torsionswinkel)
6.) Titrationnspotentiometrie
a. Beschreiben sie die Potentiometrische Titration?
b. Vorteile gegenüber klassischer Farbindikation.
Die potentiometrische Titration ist ein elektroanalytisches Verfahren zur Endpunktbestimmung in der Maßanalyse, bei dem die Spannung (Potentialdifferenz) zwischen einer Indikatorelektrode und einer Bezugselektrode gemessen wird.
Dabei wird eine Lösung in einer elektrochemischen Zelle nach klassischen Titrationsverfahren titriert, und die Veränderung der Zellspannung wird zur Aufstellung einer Titrationskurve herangezogen.
Beim Titrationsverlauf wird die Spannungsänderung in Abhängigkeit von der Zugabe des Titranten aufgezeichnet.
Der Äquivalenzpunkt zeigt sich typischerweise als sprunghafte Änderung des Elektrodenpotentials.
Vorteile gegenüber klassischer Farbindikation:
+ Indizierungen auch in trüben oder gefärbten Lösungen
+ Selektive Bestimmungen neben sonst störenden Begleitstoffen
+ Die potentiometrische Indizierung bringt keine Veränderung des Titrationsgemisches mit sich
+ Automatisierbarkeit von Titrationen
+ auch verwendbar wenn kein Indikator
Protein mit 500 AS N-acetyliert, welche Sequenzierungsmethoden sind möglich, eine davon genauer beschreiben
Ein Protein mit 500 Aminosäuren, das am N-Terminus acetyliert ist, kann nicht mittels Edman-Abbau sequenziert werden, da dieser eine freie NH₂-Gruppe benötigt.
Geeignete Methoden zur Sequenzierung:
- Massenspektrometrie-basierte Methoden (MS):
Besonders geeignet bei N-terminaler Blockade.
Häufige Verfahren: - ESI-MS/MS (Tandem-MS) mit De-novo-Sequenzierung
- PSD-MALDI aber nur bei < 2–5 kDa Fragmenten optimal
- CID (Collision Induced Dissociation), HCD, ETD oder ECD zur Fragmentierung
- MALDI-TOF mit Fragmentierung (z. B. PSD) (nur für kleine Peptide bis ca. 2 kDa)
– ESI-MS/MS mit De-novo-Sequenzierung:
1. Das Protein wird enzymatisch (z. B. Trypsin) in Peptide gespalten.
2. Die Peptide werden per ESI ionisiert und im Tandem-MS selektiert & Fragmentiert.
3. Durch Fragmentierung (z. B. CID) entstehen b- und y-Ionen.
4. Aus den Massendifferenzen der Fragmente wird die Aminosäuresequenz rekonstruiert – unabhängig vom N-Terminus.
Welche Arbeitsschritte gibt es in einem ohne gel-basierten Protomics-Workflow? Nennen Sie eine mögliche Fragestellung und die experimentelle Bedingungen um diese zu beantworten (z.B pull down,…)
einfach zusatz war nicht in dem Termin aber dann sind beide Varianten abgedeckt
- Enzymatischer Verdau → Das Proteingemisch wird mit z. B. Trypsin in AS gesplaten
- Chromatographische Trennung → Meist mittels LC (z. B. nano-HPLC).
-
Quantifizierung mittels MS → Besonders: ESI-MS/MS oder MALDI-TOF
3.1. Label-freie Quantifizierung → Nur in Ausnahmefällen; wenig präzise.
3.2. Quantifizierung mit Labels
–> stabilen Isotopen wie ²H, ¹³C, ¹⁸O werden in Proteom eingestzt
–> Chem. Isotopenmarkierung (ICAT)
–> metabolische Isotopenmarkeirung: Zellkultur (SILAC)
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* Fragestellung einem NICHT gel-basierten Protomics-Workflow:
* Welche strukturellen Änderungen verursacht eine Mutation im Proteinkomplex?
–> Bedingung: Integrative Structural Proteomics mit XL-MS, Deuterium-Austausch-MS, Cryo-EM & PC-Modellierung
Erkläre folgende 3 Proteomics-Begriffe:
* crosstalk,
* interaction proteomics,
* pull-down
19.02.24
- Crosstalk
bezeichnet das Zusammenspiel verschiedener posttranslationaler Modifikationen (PTMs) an derselben/benachbarten AS, wodurch sich diese gegenseitig beeinflussen können. Dies hat Auswirkungen auf Konformation, Stabilität, Interaktionen oder Abbau - Interaction Proteomics
untersucht Protein-Protein-Wechselwirkungen, z. B. zur Erstellung von Interaktionsnetzwerken (Interaktom).
Meist kombiniert man Pull-down-Assay mit Massenspektrometrie, wobei spezifische Interaktionen durch Kontrollexperimente von unspezifischen unterschieden werden. - Pull-down
Ein Verfahren, bei dem ein Köderprotein immobilisiert wird, um bindende Partnerproteine aus einem Zelllysat zu isolieren. Nach Waschen und Elution werden die Interaktionspartner per Massenspektrometrie identifiziert.
Erkläre PSD-MALDI, was ist der Unterschied zur de-novo-Sequenzierung
19.02.24
PSD-MALDI (Post-Source Decay – Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization):
Bei PSD-MALDI werden Peptide mittels Laserstrahl ionisiert und nach der Ionisation im feldfreien Flugrohr spontan NICHT SELEKTIV fragmentiert (postsource decay). Dabei entstehen vor allem b- und y-Ionen, aus deren Massendifferenzen sich die Aminosäuresequenz ableiten lässt.
✔️ Gut geeignet für Peptide < 2 kDa, auch wenn der N-Terminus blockiert ist.
Unterschied zur De-novo-Sequenzierung (z. B. via ESI-MS/MS):
Bei der De-novo-Sequenzierung werden Peptide im MS gezielt selektiv fragmentiert (z. B. durch CID), typischerweise nach enzymatischem Verdau (z. B. mit Trypsin).
→ Diese Methode erlaubt eine gezielte Auswahl und Fragmentierung einzelner Ionen im Tandem-MS.
✔️ Vorteile: Höhere Kontrolle, bessere Sequenzierung größerer Peptide (bis ca. 7 kDa), auch bei komplexen Mischungen.
❗ Unterscheidet jedoch nicht Leu/Ile.
