25.06.24 Flashcards
Mit welchem(n) Verfahren kann man Proteine aufkonzentrieren ?
A. Dialyse
B. Ultrazentrifugation
C. Gelchromatographie
D. Affinitätschromatographie
korrekte Antwort B. Ultrazentrifugation
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Methoden in der Proteinaufreinigung & -analyse
* Entsalzen von Proteinlösungen:
Dialyse
Ultrazentrifugation
Gelchromatographie (GPC)
* Aufkonzentrieren von Proteinlösungen:
Ultrazentrifugation
Ionenaustauschchromatographie (IEC)
* Präparative Fraktionierung von Proteinen:
Adsorptionschromatographie (z. B. HPLC)
Gelchromatographie (GPC)
Ionenaustauschchromatographie (IEC)
Isoelektrische Fokussierung (IEF)
* Analytische Fraktionierung von Proteinen:
SDS-PAGE
HPLC
Isoelektrische Fokussierung (IEF)
Affinitätchromatographie
(Gelchromatographie (GPC)& Ionenaustauschchromatographie (IEC)) hat sie nur in Klammer hinzugefügt
Was kann man mittels CD-Spektroskopie bestimmen?
A. Ob ein Protein denaturiert ist
B. Aus wievielen Untereinheiten ein Proteinkomplex besteht
C. Den Gehalt an Sekundärstrukturelementen eines unbekannten Proteins
E. Die 3D-Struktur eines unbekannten Proteins
F. Ob ein bekanntes Protein korrekt gefaltet ist
✅ A. Ob ein Protein denaturiert ist
✅ C. Den Gehalt an Sekundärstrukturelementen eines unbekannten Proteins
✅ F. Ob ein bekanntes Protein korrekt gefaltet ist
Begründung:
–>CD-Spektroskopie (Zirkulardichroismus) wird eingesetzt, um die Sekundärstruktur (Anteil von α-Helices, β-Faltblättern, Random-Coils) eines Proteins zu bestimmen
–> Durch Vergleich von CD-Spektren lässt sich feststellen, ob ein Protein denaturiert oder korrekt gefaltet ist, z. B. bei der Renaturierung oder beim Vergleich rekombinanter vs. nativer Proteine
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Falsche Antworten:
❌ B. Aus wievielen Untereinheiten ein Proteinkomplex besteht
→ Das ist keine Anwendung der CD-Spektroskopie.
❌ E. Die 3D-Struktur eines unbekannten Proteins
→ CD liefert keine Informationen über die vollständige Tertiär- oder Quartärstruktur.
Für weiche Proteine funktioniert die N-terminale Leitersequenzierung?
A. N-terminal modifizierte Proteine
B. N-terminal unmodifizierte Proteine
C. Proteine kleiner als 4 kDa
D. Proteine größer als 7 kDa
E. Tryptische Peptid-Bruchstücke
Die N-terminale Leitersequenzierung kann auf zwei Wegen erfolgen:
– klassisch über Edman-Abbau (chemisch),
– alternativ über MALDI-TOF-MS oder PSD-MALDI (massenspektrometrisch).
Korrekte Anwort B, C, E
- B. N-terminal unmodifizierte Proteine sind Voraussetzung für den klassischen Edman-Abbau, da ein freier N-Terminus notwendig ist.
- C. Proteine < 5 kDa (z. B. < 4 kDa) eignen sich besonders gut, da bei höheren Molekulargewichten die Massenspektren zunehmend unübersichtlich werden.
- E. Tryptische Peptid-Bruchstücke können nicht mit Edman, aber sehr wohl mit PSD-MALDI sequentiert werden, das ebenfalls eine „Leiter“ aus Fragment-Ionen erzeugt.
(Im Skript wird PSD-MALDI direkt als Alternative zur Edman-basierten Leitersequenzierung dargestellt – mit dem Vorteil, auch Gemische und modifizierte Peptide (wie tryptische Fragmente) untersuchen zu können.)
- Welche Aussagen treffen auf eine elektrochemische Zelle bestehend aus einem Rhodium-Stab in Rhodiumionenlösung (Rh/Rh³⁺ + 0.758 V) und einem Kupfer-Stab in Kupferionenlösung (Cu/Cu²⁺ + 0.339 V) zu?
A. Rh³⁺ + 3e⁻ → Rh(O)
B. Cu²⁺+ 2e⁻ → Cu(0)
C. Rh(0) → Rh³⁺+ 3e⁻
D. Cu(0) → Cu²⁺+ 2e⁻
E. Der Rhodium-Stab ist die Anode
F. Der Kupfer-Stab ist die Anode.
G. An der Kathode findet eine Oxidation statt
H. An der Kathode findet eine Reduktion statt.
EB: das was Stärker + geladen ist nimm lieber Elektronen auf und wird dabei Reduziert “Rh”, das was weniger positiv geladen ist gibt lieber Elektronen ab und wird dabei Oxidert “Cu”
Anode A–> minus - gleich negativer geladene Metall = Cu
OxidAtion = Anode
ReduKtion= Kathode
Korrekte Antwort:
* A. Rh³⁺ + 3e⁻ → Rh(0)
Das ist die Reduktion an der Kathode
* D. Cu(0) → Cu²⁺ + 2e⁻
Anode (Oxidation)
* F. Der Kupfer-Stab ist die Anode
* H. An der Kathode findet eine Reduktion statt
Nennen Sie 3 Methoden zur Analyse der dreidimensionalen Struktur von Proteinen und beschreiben Sie eine davon etwas genauer!
dreidimensionale Struktur“ = „Tertiärstruktur“
A. Röntgenkristallographie (X-Ray)
B. NMR-Spektroskopie (Nuclear Magnetic Resonance)
C. Kryo-Elektronenmikroskopie (Cryo-TEM)
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Röntgenstrukturanalyse – Schritte zur 3D-Strukturbestimmung von Proteinen:
1. Kristallisation:
Gereinigtes Protein wird durch langsame Dampfdiffusion (z. B. „hanging drop“) kristallisiert.
2. Kristallcharakterisierung:
Prüfung auf Größe, Raumgruppe und Einheitszelle; typischerweise 50–60 % Kristallwasser.
3. Röntgenbeugung:
Kristall wird mit Röntgenstrahlen bestrahlt; Beugungsmuster werden aufgezeichnet.
4. Phasenbestimmung:
Die Phaseninformation wird indirekt gewonnen (z. B. mit Schweratomen), da sie nicht direkt messbar ist.
5. Elektronendichtekarte & Modellierung:
Aus den Beugungsdaten wird eine 3D-Elektronendichtekarte berechnet, in die die Polypeptidkette anhand der Sequenz eingefügt wird.
6. Verfeinerung:
Das Strukturmodell wird angepasst; Auflösung meist 2–3 Å, atomare Auflösung ab 1 Å möglich.
Welche Arbeitsschritte gibt es in einem gel-basierten Protomics-Workflow? Nennen Sie eine mögliche Fragestellung und die experimentelle Bedingungen um diese zu beantworten (z.B pull down,…)
Zusatz von 07.04.21: Was ist eine Perturbationsanalyse?
Klassische gel-basierte Proteomanalyse
* 2D- Gelelektrophorese: IEF und SDS-PAGE (Auftrennung & Extraktio
* Bis zu 10 000 Komponenten, in jedem Spot können mehrere Proteine sein
* Quantifizierung über Anfärben (z.B. Coomassie): bis zu 20% Fehler
* Enzymatische Spaltung im Gel
* Elution mit organischen Lösungsmitteln
* Identifizierung über MS: entweder Abgleich von Peptidmassen mit Datenbanken (peptide mass fingerprint); oder Abgleich von Tandem-MS-Spektren mit Datenbanken
* Pertubationsanalyse
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* I. Mögliche Fragestellung:
Welche Proteine binden spezifisch an ein Zielprotein (z. B. einen Rezeptor)
–>Passende experimentelle Bedingung:
Pull-Down-Assay mit dem Zielprotein als Köder, gefolgt von 2D-Gelelektrophorese und Ms (Massenspektrometrie) zur Identifikation der gebundenen Proteine.
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* Perturbationsanalyse:
-omics-basierter Ansatz, bei dem ein definiertes System gezielt gestört wird (z. B. durch Wirkstoffe oder Mutationen). Anschließend werden die resultierenden Veränderungen quantitativ analysiert, da jede beobachtete Veränderung direkt auf die Störung zurückgeführt werden kann. Ziel ist es, funktionelle Netzwerke und Signalwege sichtbar zu machen
Beschreiben Sie SDS-PAGE und nennen Sie Anwendungsgebiete
SDS-PAGE ist eine Methode zur Trennung von Proteinen ausschließlich nach ihrer Molekülmasse (20-250 kDa).
Durch das anionische Detergens SDS (Sodium dodecyl sulfate) werden Proteine denaturiert, in stäbchenförmige Strukturen überführt und mit einer negativen Ladung pro ~2 Aminosäuren versehen. Diese überlagert die Eigenladung, sodass alle Proteine ein einheitliches Ladung-zu-Masse-Verhältnis besitzen. Disulfidbrücken werden zusätzlich durch Reduktionsmittel (z. B. DTT, β-Mercaptoethanol) gespalten.
Im Polyacrylamid-Gel (PAGE) wirken definierte Poren als molekulares Sieb-Effekt:
Je größer ein Protein, desto stärker wird es gebremst, während kleine Proteine weiter wandern. Die Laufstrecke in SDS-PAGE ist umgekehrt proportional zur log(Molekülmasse).
Das am häufigsten verwendete Puffersystem ist das Lämmli-System mit Sammelgel und Trenngel, das eine Fokussierung der Banden erlaubt. Die aufgetrennten Proteine werden durch Anfärbung mit Coomassie-Brillantblau sichtbar gemacht
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Anwendungsgebiete:
* haupsächlich Anwendung in der Analtytik bei folgenden Fragestellungen
* Ist mein Proteingemisch rein? (Reinheit)
* Welche Molekülmasse haben die enthaltenen Proteine? (MW)
* Wie hoch ist die ungefähre Proteinkonzentration (nur Semiquantitative Aussage) ?
Nehmen Sie an, Sie wollen einen Wirkstoff für ein bestimmtes Target entwickeln.
Welche analytischen Möglichkeiten haben Sie, um die Affinität von Wirkstoff-Kandidaten an ihrem Target zu bestimmen?
Nennen Sie verschiedene Analysenmethoden und Beschreiben Sie eine davon etwas genauer.
(aka Bindungsanalytik)
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(Welche 4 nicht kovalenten WW spielen bei der Wirkstoff-Target-Bindung eine Rolle? Ionische WW)
Die Affinität zwischen Wirkstoff und Target kann z. B. mit Antigen-Antikörper-Reaktionen (Immunologische Techniken) als Bindungssystem genutzt werden, deren Stärke mit folgenden Methoden gemessen wird.
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Radioimmunoassay
Verdrängungsassay mit radioaktiv markiertem Antigen; sehr sensitiv; quantifiziert z. B. Hormonbindung -
ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) (insb. Sanwich-ELISA)
quantitativer Nachweis über Enzym-gekoppelten Antikörper; v. a. zur Bestimmung von Protein/Antigen-Bindung -
Biacore-Technik (SPR Surfaceplasmonenresonanz basiert)
misst Bindung in Echtzeit, labelfrei, über Änderung des Brechungsindex an Oberfläche (Sensorchip) -
Isotherme Titrationskalorimetrie (ITC isothermal titration calorimetry)
misst Wärmeänderung bei Ligandenbindung → dadruch Berechnung von Ka, ΔH, ΔG, ΔS -
Rasterkraftmikroskopie (AFM) atomic force microscopy
Funktionalisierte Spitzen zur einzelmolekularen Kraftmessung zwischen Ligand und Target (nur kurz erwähnt)
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Die Biacore-Technik nutzt Oberflächenplasmonenresonanz (SPR) zur labelfreien Echtzeitmessung von Bindungsreaktionen.
Ein Bindungspartner wird auf einem Sensorchip immobilisiert, der zweite strömt in Lösung vorbei. Änderungen im Brechungsindex zeigen Assoziation und Dissoziation, daraus lassen sich Bindungskinetik (ka, kd) und Affinität (KD) berechnen.
Die Methode ist universell einsetzbar, hochsensitiv, benötigt keine Markierung und arbeitet mit geringen Proteinmengen.
Ideal zum Screening großer Substanzbibliotheken, um hochaffine Bindungspartner für ein Target zu identifizieren.
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NON kovalenten WW:
Ionische WW / HBB / Van der Waals Kräfte/ Hydrophobe WW
Erklären Sie, wie man mittels elektrochemischer Methoden den pH-Wert messen kann!
Der pH-Wert kann mittels potentiometrischer Direktmessung bestimmt werden. Dabei wird die Spannung (Potentialdifferenz) zwischen einer pH-sensitiven Glaselektrode (Indikatorelektrode) und einer Bezugselektrode gemessen. Die Spannung ist gemäß der Nernst’schen Gleichung abhängig von der Konzentration der Wasserstoffionen (Hydroxoniumionen) und damit direkt vom pH-Wert.
Die Glaselektrode reagiert auf die Aktivität der H⁺-Ionen durch Ionenaustausch an der Glasmembran. Die entstehende Potentialdifferenz an der äußeren Grenzfläche (U₄) ist entscheidend für die Messung. Die resultierende Spannung wird mit Standardpufferlösungen verglichen, um den pH-Wert zu berechnen.
Das System wird meist als Einstabmesskette aus Glaselektrode + Ag/AgCl-Referenzelektrode realisiert. Die Methode ist schnell, präzise, temperaturabhängig und im Europäischen Arzneibuch als Standardverfahren zur pH-Bestimmung aufgeführt.
Erklären Sie kurz folgende Begriffe aus der Bioanalytik
A .Sequential walk
B. Collision induced dissociation
C. Perturbationsanalyse
D. Spinsystem
E. Ramachandran-Plot
F. Elektroosmotischer Fluss
(G. elektrochemische Spannungsreihe)
- Sequential Walk:
Verfahren in der NMR-Proteinstrukturanalyse, bei dem mittels NOESY-Kreuzsignale benachbarte Aminosäuren entlang des Backbones schrittweise zugeordnet werden. - Collision Induced Dissociation (CID):
Tandem-MS-Methode, bei der selektierte Ionen durch Kollision mit Inertgasen (Argon) gezielt fragmentiert werden, dient der Sequenzaufklärung von Peptiden. - Perturbationsanalyse
Ist ein Proteomik-Ansatz, bei dem gezielte Störungen (z. B. durch Wirkstoffe, Mutationen) im biologischen System eingesetzt werden, um systematisch Proteomveränderungen und damit Signalwege, Netzwerke und Effekte der Störung zu analysieren. - Spinsystem:
= jede kontinuierliche Kette von Protonen, die an benachbarten Kernen gebunden sind, also eine Kette von vicinal koppelnden Protonen, z.B. jede einzelne Aminosäure in einem Protein. - Ramachandran-Plot
Zeigt die zulässigen Kombinationen der Torsionswinkel φ (phi) und ψ (psi) im Polypepti-Backbone eines Proteins und gibt Hinweise auf typische Sekundärstrukturen wie α-Helices und β-Faltblätter. - Elektroosmotische Fluss (EOF)
ein Transportphänomen in der Kapillarelektrophorese, bei dem durch das angelegte elektrische Feld eine bewegliche Doppelschicht an der negativ geladenen Kapillarwand mitgezogen wird, wodurch sich die gesamte Flüssigkeit kolbenförmig in Richtung Kathode bewegt. - Elektrochemische Spannungsreihe
Ist eine aufsteigende Ordnung von Redoxpaaren nach ihrem Standardelektrodenpotenzial gegenüber der Standardwasserstoffelektrode.
Sie zeigt, welche Stoffe leichter oxidiert (unedel) oder reduziert (edel) werden.
