3 _ Transformatie van E. Coli en Blauw - Wit screening Flashcards
Wat is er zo speciaal aan het GPF of Groen Fluorescent Proteïne?
Dit is een gen dat ervoor zorgt dat er groen licht kan uitgezonden worden met behulp van een UV - lamp.
Waarom gaan we eigenlijk screenen?
Dit is nodig voor na te gaan of de plasmide het extra gen wel degelijk heeft opgenomen.
Het zou namelijk kunnen dat het gewenst stukje DNA door de plasmide is opgenomen maar het zou ook kunnen dat de “sticky - ends” van de plasmide zelf terug aan elkaar gaan binden.
Waarom gaan we het LacZ - gen gebruiken ? Leg hiermee ook uit proces van de blauw - wit screening uit.
Deze gaat coderen voor het enzym β – galactosidase
In normale omstandigheden zal dit enzym lactose gaan opsplitsen in sucrose en galactose.
Deze wordt tijdens de screening gebruikt om na te gaan of het nieuw gen stukje al dan wel of niet is opgenomen in de plasmide.
We hebben het nieuwe gen stukje namelijk in het LacZ - gen zelf gezet met als gevolg dat alle getransformeerde cellen geen β – galactosidase meer zullen kunnen aanmaken.
Voor na te kijken welke cellen de het gen hebben opgenomen en welke niet, kunnen we een blauw - wit screening gaan uitvoeren.
De cellen waarbij het LacZ - gen nog heel is (het niet stukje DNA is dus niet opgenomen, dit is hetgeen wat we net niet wensen), zullen nog steeds β – galactosidase gaan kunnen produceren. Dit enzym kan zowel lactose als de lactose - analoog X - gal gaan splitsen. Bij de splitsing van X - gal zal een blauw product gevormd worden waardoor men de blauwe kolonies op een medium gemakkelijk zal kunnen onderscheiden van de andere, witte kolonies die het nieuwe gen stukje hebben opgenomen en geen β – galactosidase meer kunnen aanmaken en de X - gal (lactose - analoog) niet meer kunnen afbreken en daardoor geen blauw product zullen vormen.
Hoe komt het dat antibiotica - resistentie is opgetreden tussen bacteriën?
A. Het uitwisselen van plasmiden
B. Het veelvuldig muteren van het DNA van bacteriën
C. Door de snelle voortplanting treden er sneller mutaties op
D. Mensen hebben dit zelf gedaan door experimenten
A. Het uitwisselen van plasmiden
Welke stof activeert het GPF - gen en wat gebeurt er dan?
Het GPF - gen wordt geactiveerd door het suiker arabinose zal dan een groene fluorescentie krijgen onder UV - licht.
J / F
Aangezien arabinose suiker een energie en koolstofbron is voor bacteriën, worden er hier constant verteringsenzymen voor geproduceerd.
FOUT
Er worden enkel verteringsenzymen voor een stof geproduceerd, indien die stof ook aanwezig is.
Indien alle arabinose suiker in dit geval dus zou zijn verteerd, stopt de productie van de verteringsenzymen hiervan
Geef een voorbeeld waar genregulatie zeer belangrijk is.
Dit is bijvoorbeeld heel belangrijk bij verteringsenzymen, indien de te verteren stof niet meer aanwezig is, heeft het geen zin meer om energie te steken in het produceren van verteringsenzymen.
Wat is de functie van AraC binnen het arabinose - operon ?
AraC is de repressor binnen het arabinose - operon. Dit betekent dat araC op de Pbad - promotor zal binden bij afwezigheid van arabinose suiker, zo kan er geen RNA - polymerase meer binden om het DNA af te lezen.
Uit welke cluster van genen bestaat het arabinose - operon ?
araB, araA & araD
Wat zijn de verschillende genen die noodzakelijk zijn voor de replicatie en en fluorescente eigenschappen? (6)
- GFP : Het gen van de kwal dat codeert foor de productie van de groen fluorescerend proteïne
- Bla : Een gen dat codeert het β – lactase enzym dat ampicilline afbreekt, selectie van deze plasmiden / bacteriën gebeurt door ze op voedingsbodems met ampicilline te kweken
- Ori : De oorsprong van de pGLO plasmide voor de DNA replicatie
- araC : Een gen dat codeert voor het regulatie proteïne dat bindt met de PBAD promotor, enkel wanneer arabinose bindt met het araC proteïne, kan de productie van GFP gestart worden
- PBAD : Een specifieke DNA sequentie voor het GFP gen dat araC met arabinose bindt, RNA polymerase binding promoot & transcriptie van het GFP – gen
- Meerdere klonering plaatsen : Plaatsen met gekende restrictie – plaatsen die insertie toelaten of verwijdering van een gen naar interesse
Bespreek de stappen die moeten doorlopen worden voor de transformatie uit te voeren?
Stap 1 : Gebruik competente E. Coli cellen
- Zorg dat deze behandeld zijn met calcium ionen zodat de celmembranen meer toelaatbaar zijn naar de plasmiden
- Calcium gaat ervoor zorgen dat de plasmiden op de celwand zullen neerslaan en/of zal de negatieve lading van de fosfaatbruggen gaan neutraliseren.
Stap 2 : Voer de procedure uit die ook wel “heat shock” wordt genoemd
- Deze “hitte shock” zal de permeabiliteit van het celmembraan doen stijgen
- Daarnaast gaat het grote temperatuurverschil tussen het binnenste en het buitenste van de cel een “stroom” creëren die de plasmiden naar binnen zullen trekken.
Indien de plasmiden belangrijke eigenschappen bevatten die eerst tot uiting moeten komen, moet de volgende stap ook nog uitgevoerd worden :
Voorzie de cellen dan van voldoende nutriënten en een korte incubatietijd voor hun nieuwe eigenschappen tot expressie te laten komen.
- Dit is bijvoorbeeld nodig voor de PGLO - plasmide aangezien deze wel een Bla - gen bezit dat resistentie biedt tegen ampicilline, je moet de bacteriën even tijd geven vooraleer je ze op een ampicilline bodem gaat zetten.
Wat bedoeld men ermee als men zegt dat de plasmide aan zichzelf gaat ligeren? Is dit positief of negatief als we een nieuw DNA stukje er willen in steken?
Hiermee wordt er bedoeld dat de “sticky ends” van de plasmide zelf terug aan elkaar zullen gaan binden.
Dit is negatief aangezien ze het nieuw stukje DNA dan niet hebben opgenomen.
Wat bedoeld men met “Insertionele inactivatie”
Hiermee bedoeld men dat men een gen gaat inactiveren door er een ander gen tussen te zetten waardoor transcriptie niet meer kan door gaan en het gen geïnactiveerd wordt.
Wat is de transformatie – efficiëntie ?
Dit is een formule om na te gaan hoe efficiënt het transformatieproces was.
transformatie-efficiëntie=(totaal aantal kolonies op de LB/amp/ara-plaat dat oplicht )/(hoeveelheid DNA verspreid op deze plaats in µg)
