1 _ Plasmabereiding volgens de Qaigen procedure en agarosegel - elektroforese van de bekomen plasmiden

Question 1

Uit welke bacterie komen de plasmide pUC18 & pUC19?

Answer 1

E. Coli

Question 2

Waarom gebruiken we de pBR322 plasmide?

Answer 2

Dit is een referentieplasmide om de opbrengst te schatten

Question 3

Definitie plasmiden

Answer 3

Kleine, extra chromosomale, circulaire dsDNA - moleculen die zich onafhankelijk van de gastheercel repliceren. Ze komen voor bij de meeste bacteriën en bij gist.
Plasmiden bevatten genen die coderen voor eiwitten die niet - essentieel zijn voor het metabolisme van de gastheer maar vaak wel nuttig zijn.

Question 4

Doel plasmiden

Answer 4

Plasmiden zijn geschikt om stukken DNA van een andere herkomst in een bacterie of gistcel binnen te brengen.
Plasmide dient hier dan als een vector.

Question 5

Wat is een ampicilline - resistentie gen?

Answer 5

Dit gen zorgt ervoor dat de bacterie / gistcel op een voedingsbodem met ampicilline kan overleven.

Question 6

Wat zijn de eigenschappen van de pBR322?

Answer 6

De pBR322 plasmide is een referentie plasmide, hiervan weten we welke hoeveelheid van de plasmide in de oplossing aanwezig is.
De plasmide bevat ook een resistentie - gen voor ampicilline en tetracycline.

Question 7

Wat bevindt zich in het Lacz - gen?

Answer 7

Een cloning - site, hier kunnen we gaan knippen en plakken.

Question 8

Wat bedoeld men met het decanteren van supernatans?

Answer 8

Men bedoelt hiermee dat men de oplossing bovenop de pellet (als gevolg van het centrifugeren) gaat weggieten.

Question 9

Wat is een centrifuge?

Answer 9

Een centrifuge is een apparaat dat middelpuntvliedende kracht gebruikt om verschillende componenten van een vloeistof te scheiden.
Dit wordt bereikt door de vloeistof met hoge snelheid in een container rond te draaien, waardoor vloeistoffen met verschillende dichtheden (bijv. Room uit melk) of vloeistoffen van vaste stoffen worden gescheiden.

Question 10

Hoeveel geraakt er in een Falconbuis?

Answer 10

50 mL

Question 11

J/F
Je mag eender welke tip op een micropipet zetten, het enige wat belangrijk is, is dat je nooit meer vloeistof probeert op te nemen dan de maximum van die specifieke ‘tip’

Answer 11

FOUT
Naast het feit dat het belangrijk is dat je nooit over de maximum van elke ‘tip’ gaat, is het ook zeer belangrijk om steeds de zo kleinst mogelijke tip te nemen
Bv
Als je een vloeistof moet opnemen van 19 mL dan gebruik je de tip die zo dicht mogelijk bij deze hoeveelheid ligt, in ons geval zal dit 20 mL zijn, je neemt er geen grotere van bv 50 mL

Question 12

Gegeven :  
- Pipet : 2 mL 
- Pipet : 20 mL 
- Pipet : 200 mL 
Je moet alle vloeistof uit een Epje opnemen, welke pipet ga je gebruiken? 
A. Het maakt niet uit welke pipet, zolang ik er de juiste 'tip' op zet 
B. De pipet van 20 mL 
C. De pipet van 200 mL 
D. De pipet van 2 mL

Answer 12

D. De pipet van 2 mL

Question 13

J/F
Tijdens het pipeteren moet je tijdens het opnemen van de vloeistof in de tip van de pipet slechts tot de eerste stop doordrukken en dan loslaten om de stof op te nemen, je drukt enkel door tot de tweede stop indien je de vloeistof terug uit de pipet wil doen.

Answer 13

Juist

Question 14

J/F
Indien je iets bent aan het pipeteren, moet je dit op de bank zelf doen, zo ver mogelijk weg van je gezicht om contaminatie te voorkomen.

Answer 14

Fout

Je moet altijd pipeteren op ooghoogte.

Question 15

Hoe noemen de centrifuges die wij gebruiken voor kleine hoeveelheden

Answer 15

Microcentrifuges of microfuges

Question 16

Wat is het doel van de Qaigen procedure?

Answer 16

Het opzuiveren van de plasmiden uit celmateriaal

Question 17

Wat zijn de verschillende stappen van de Qaigen procedure? Leg ze ook uit.

Answer 17

Stap 1 : Oplossen van de pellet

Stap 2 : Lyseren van de cellen door gebruik te maken van een detergent

• Deze gaat de cellen openbreken
• De detergent kan de cellen gaan openbreken omdat de stof er hetzelfde uitziet als het plasmamembraan waardoor het het membraan kan binnendringen en open breken

Stap 3 : Denaturatie + precipitatie : pH = 12 (NaOH)

• Door de hoge pH zal alles gaan afbreken, zowel plasmide, DNA, RNA, denaturatie van eiwitten, ….
• Hierdoor zal alles gaan neerslaan

Stap 4 : Renaturatie plasmide (korte stap) : pH = 7

• Er wordt een zuur aan toegevoegd om de pH te verlagen naar 7
• Zowel de plasmiden als het DNA kunnen in deze stap terug gaan beginnen renatureren, maar aangezien de plasmide veel kleiner is dan het DNA zal deze ook veel sneller gaan renatureren.

Stap 5 : Plasmiden binden op silicamembraan

• Men gaat hier gebruik maken van een silica - kolom, simpelweg ga je een epje met een membraan in, in een ander epje steken
• Alle vloeistof zal erdoor lopen behalve het plasmide - DNA

Stap 6 : Hierbij gaan we de plasmiden wassen van het membraan met behulp van water (of een andere niet - zoute vloeistof)

Question 18

Hoe kan het dat enkel de plasmiden aan het silica - membraan blijven hangen en niet het andere DNA?

Answer 18

Doordat we tijdens de Qiagen eerst een sterke base gaan toevoegen (NaOH) en hierna een zwakker zuur aan toevoegen om de pH terug te verlagen naar 7, zal er een zout gevormd worden dat zich ook mee vanonder zal vormen tussen al het andere gedenatureerd celmateriaal.
Aangezien de plasmiden bij de renaturatie wel zullen kunnen gaan renatureren (aan elkaar binden), zullen ze terug opgelost worden in de vloeistof en zullen ze zich niet meer op de bodem bevinden, waar net het zout zich gaat vormen tussen al het andere celmateriaal.

Question 19

Wat is het doel van een ‘Quick spin’

Answer 19

Het zou ervoor moeten zorgen dat alle inhoud van het Epje, volledig in de tip zit en er geen kleine vloeistofdruppeltjes meer aan de kant blijven kleven.

Question 20

Waarom gebruikt men Broom - fenol blauw bij de gelelektroforese?

Answer 20

Deze kleurstof zorgt ervoor dat dat we kunnen zien hoe ver de oplossing aan DNA doorheen de gel is gekropen.
Zo kunnen we ervoor zorgen dat het DNA niet langs de andere kant de gel terug verlaat

Question 21

Waarom voegt men glycerol toe aan de DNA stalen die men in de gelelektroforese stopt?

Answer 21

Glycerol is zwaarder dan water, hierdoor is men zeker dat de DNA - oplossing naar de bodem zinkt en op de bodem blijft.

Question 22

J/F

Hoe lager de concentratie aan agarose in de gel voor de gelelektroforese, hoe kleiner de poriën in de gel.

Answer 22

FOUT
Lage concentratie, grote poriën
Hoge concentratie, kleine poriën

Question 23

Men gebruikt stroom bij een gelelektroforese omdat
A. De fosfaatruggengraten positief geladen zijn
B. De gel onder stroom moet te komen staan
C. De Buffer geladen moet worden
D. De fosfaatruggengraten negatief geladen zijn

Answer 23

D. De fosfaatruggengraten negatief geladen zijn

Question 24

J/F
De negatieve pool wordt gekoppeld aan het begin bij de gootjes, de positieve pool zo ver mogelijk weg van de gootjes (aan de andere kant)

Answer 24

JUIST

Question 25

Hoe komt het dat we een ladder te zien krijgen en niet gewoon 1 grote streep?

Answer 25

Dit is een gevolg van het verschillend gedrag van de verschillende lengten van DNA moleculen.
Lange DNA - strengen zullen veel trager doorheen de gel kruipen dan kleine aangezien ze groter zijn en gemakkelijker ‘vast’ geraken.
Zo zullen de lange stukjes DNA op het einde nog veel dichter tegen het startpunt zitten terwijl de kortere stukjes DNA veel verder zullen zijn geraakt.

Question 26

Waarom zal men steeds ook een oplossing DNA dat reeds gekend is, mee in de gelelektroforese steken?

Answer 26

Dit is voor 2 redenen

• Voor de concentratie te bepalen (is de de kleur van het gekende staal dieper / even diep / minder duidelijk dan die van het te onderzoeken staal?
• Voor de lengte van de DNA - fragmenten te kunnen meten, aan de hand van het reeds gekende staal, weet men het aantal basenparen van de verschillende fragmenten die men zo kan vergelijken met de ladder van het te onderzoeken DNA staal.

Question 27

Waarom zet men de gel een aantal mm onder met een buffer?

Answer 27

• Deze zorgt ervoor dat de gel niet zal uitdrogen

- Zal ook de warmte gaan afvoeren die gegenereerd wordt door de 2 polen

Question 28

Wat is “Fast Blast DNA stain”? Wat is hierbij belangrijk?

Answer 28

Dit is een kleuroplossing die ervoor zal zorgen dat we de verschillende banden, ook na dat de gelelektroforese is afgelopen, zichtbaar blijven.
Hierdoor kunnen we ook de resultaten analyseren.
Het is belangrijk dat dit in het donker gebeurd.

Question 29

Wat is het doel van de gelelektroforese?

Answer 29

Het scheiden van moleculen op basis van grootte van DNA fragmenten en de concentratie van het geëxtraheerd DNA bepalen.

Question 30

Waarom wordt een SLM oplossing gebruikt?

Answer 30

Deze gaat eerst en vooral alle reacties stil leggen (dit is een gevolg van de EDTA die de werking van eventuele enzymen zal stop leggen). Verder zullen eventuele enzymen ook gedenatureerd worden door aanwezigheid van SDS.
Daarnaast bevat deze ook glycerol waardoor de oplossing zwaarder wordt en naar beneden gedrukt zal worden