2.2 : enzymes de réplication Flashcards
Quelles sont les enzymes requises pour la réplication de l’ADN?
- ADN gyrase (superenroulements négatifs)
- Hélicases pour séparer les brins d’ADN
- Protéine qui empêche les 2 bras parentaux de se réassocier avant d’avoir été répliqués
- Primases (synthèse d’amorces d’ARN)
- ADN réplicase
- Enzyme pour enlever les amorces d’ARN
- Enzyme pour ligaturer de manière covalente les fragments d’Okazaki
Qu’est-ce que l’ADN pol I?
- Monomère de 928 a.a (103 kDa)
- ADN pol fidèle
- Enzyme processive : elle copie 20 nt de la matrice avant de se dissocier
Comment l’ADN pol I a été découverte?
- La première ADN pol identifiée chez E. coli
- Découverte par Kornberg grâce à son habileté à incorporer de la thymidine dans l’ADN
Vrai ou faux :
L’ADN pol I est la réplicase.
Faux, elle joue un rôle dans la réplication d’ADN mais celui-ci n’est pas majeur
Qu’est-ce que le degré de processivité d’une ADN polymérase?
Nombre moyen de nt que l’enzyme ajoute à chaque fois qu’elle se lie à une jonction d’amorce (matrice) → efficacité
Une fois les nucléotides ajoutés, pourquoi l’ADN pol I se libère-t-elle rapidement de la matrice?
Car pas de domaines qui permettent à l’ADN pol I de rester fixé à la matrice
Qu’est-ce qui fait que l’ADN pol I est très fidèle? Quel est le prix de cette fidélité?
- Elle peut corriger ses fautes à l’aide d’une fonction précise
- Prix : 3% des nt correctement incorporés sont excisés
En plus de son activité polymérase (5’-3’), pol I possède 2 autres activités. Lesquelles?
- Exonucléase 5’-3’
- Exonucléase 3’-5’ (PROOFREADING)
Grâce à quelle fonction pol I peut-elle corriger ses fautes? Comment?
- Exonucléase 3’-5’
- Si pol I incorpore un nt erroné (mal apparié) à l’extrémité croissante d’un brin d’ADN (3’), l’activité polymérase est inhibée et l’exonucléase 3’-5’ excise ce nt → empêche les mutations dans l’ADN
Que fait la fonction exonucléase 5’-3’ de pol I?
- Permet à pol I de se lier à un site de coupure simple-brin sur l’ADN duplex → pol I coupe l’ADN près de la cassure et libère un ou des nt.
Vrai ou faux :
Pol I enlève des amorces d’ARN
Vrai, se fixe au site de coupure et peut enlever une amorce d’ARN
Différence entre exonucléase 3’-5’ et exonucléase 5’-3’ au niveau de la libération de nt suite à leurs actions respectives?
- 3’-5’ : Enlève seulement des mononucléotides (1 à la fois)
- 5’-3’ : permet la libération de mononucléotides ou d’oligonucléotides (plusieurs)
Vrai ou faux :
le site actif de l’exonucléase 3’-5’ est capable de spécifiquement reconnaître les bases mal appariées.
Faux, pas capable. C’est pol I qui a cette fonction et “active” la fonction exonucléase.
Vrai ou faux :
Pol I possède 3 sites actifs
Vrai,
- fonction polymérase (103 kDa)
- exonucléase 3’-5’ (68 kDa)
- exonucléase 5’-3’ (35 kDa)
À quoi ressemble la structure de l’ADN pol I? Les 3 sites actifs correspondent à…?
- Main
- Doigts, paume et pouce
Où est localisé le site actif de la polymérase? Le site actif de l’exonucléase 3’-5’?
Les 2 sont dans la paume, mais à 2 endroits distincts
Polymérase = dans le “creux”
À quoi servent les 2 résidus Lys et Arg (2 chambres)?
À stabiliser le pyrophosphate
Quel est le rôle des 4 doigts?
- Rôle dans la présentation de la matrice (interactions hydrophobiques)
- Aident à stabiliser le pyrophosphate avec les résidus Lys et Arg
- Introduisent une rotation de 90 Degrés
Quel est le rôle du pouce de pol I?
Interagit avec l’ADN et réduit le taux de dissociation de pol I
Quel est le rôle de la paume de pol I?
- Proofreading → liens H si les nucléotides sont bien appariés
- Synthèse, car contient le site actif de l’activité polymérase
Comment a-t-il été démontré que l’ADN pol I n’est pas la réplicase?
- Cairns et De Lucia
- Isoler un mutant de Pol I d’E. coli avec moins de 1% de l’activité polymérase sauvage
- Mutant se multipliait à une vitesse normale sans l’activité polymérase
Cairns et De Lucia ont travaillé avec un mutant avec très peu d’activité polymérase. Ce mutant est très sensible aux UV et aux agents mutagènes chimiques. Qu’est-ce que cela suggère?
Suggère que pol I joue un rôle clé dans la réparation d’ADN.
Un brin d’ADN contenant une lésion chimique (endommagé) est souvent clivé du côté…? Qu’est-ce que cela implique?
- 5’
- Active l’activité exonucléase 5’-3’ de pol I → pendant qu’elle excise l’ADN endommagé, pol I comble la brèche grâce à son activité polymérase (resynthèse)
Pol I catalyse le déplacement d’une cassure simple brin ou double brin? Explique
- Simple brin (NICK translation)
- La réaction de déplacement d’une cassure sert à introduire des nucléotides radioactifs dans de l’ADN in vitro → sondes moléculaires en génie génétique