2.2 : enzymes de réplication Flashcards
Quelles sont les enzymes requises pour la réplication de l’ADN?
- ADN gyrase (superenroulements négatifs)
- Hélicases pour séparer les brins d’ADN
- Protéine qui empêche les 2 bras parentaux de se réassocier avant d’avoir été répliqués
- Primases (synthèse d’amorces d’ARN)
- ADN réplicase
- Enzyme pour enlever les amorces d’ARN
- Enzyme pour ligaturer de manière covalente les fragments d’Okazaki
Qu’est-ce que l’ADN pol I?
- Monomère de 928 a.a (103 kDa)
- ADN pol fidèle
- Enzyme processive : elle copie 20 nt de la matrice avant de se dissocier
Comment l’ADN pol I a été découverte?
- La première ADN pol identifiée chez E. coli
- Découverte par Kornberg grâce à son habileté à incorporer de la thymidine dans l’ADN
Vrai ou faux :
L’ADN pol I est la réplicase.
Faux, elle joue un rôle dans la réplication d’ADN mais celui-ci n’est pas majeur
Qu’est-ce que le degré de processivité d’une ADN polymérase?
Nombre moyen de nt que l’enzyme ajoute à chaque fois qu’elle se lie à une jonction d’amorce (matrice) → efficacité
Une fois les nucléotides ajoutés, pourquoi l’ADN pol I se libère-t-elle rapidement de la matrice?
Car pas de domaines qui permettent à l’ADN pol I de rester fixé à la matrice
Qu’est-ce qui fait que l’ADN pol I est très fidèle? Quel est le prix de cette fidélité?
- Elle peut corriger ses fautes à l’aide d’une fonction précise
- Prix : 3% des nt correctement incorporés sont excisés
En plus de son activité polymérase (5’-3’), pol I possède 2 autres activités. Lesquelles?
- Exonucléase 5’-3’
- Exonucléase 3’-5’ (PROOFREADING)
Grâce à quelle fonction pol I peut-elle corriger ses fautes? Comment?
- Exonucléase 3’-5’
- Si pol I incorpore un nt erroné (mal apparié) à l’extrémité croissante d’un brin d’ADN (3’), l’activité polymérase est inhibée et l’exonucléase 3’-5’ excise ce nt → empêche les mutations dans l’ADN
Que fait la fonction exonucléase 5’-3’ de pol I?
- Permet à pol I de se lier à un site de coupure simple-brin sur l’ADN duplex → pol I coupe l’ADN près de la cassure et libère un ou des nt.
Vrai ou faux :
Pol I enlève des amorces d’ARN
Vrai, se fixe au site de coupure et peut enlever une amorce d’ARN
Différence entre exonucléase 3’-5’ et exonucléase 5’-3’ au niveau de la libération de nt suite à leurs actions respectives?
- 3’-5’ : Enlève seulement des mononucléotides (1 à la fois)
- 5’-3’ : permet la libération de mononucléotides ou d’oligonucléotides (plusieurs)
Vrai ou faux :
le site actif de l’exonucléase 3’-5’ est capable de spécifiquement reconnaître les bases mal appariées.
Faux, pas capable. C’est pol I qui a cette fonction et “active” la fonction exonucléase.
Vrai ou faux :
Pol I possède 3 sites actifs
Vrai,
- fonction polymérase (103 kDa)
- exonucléase 3’-5’ (68 kDa)
- exonucléase 5’-3’ (35 kDa)
À quoi ressemble la structure de l’ADN pol I? Les 3 sites actifs correspondent à…?
- Main
- Doigts, paume et pouce
Où est localisé le site actif de la polymérase? Le site actif de l’exonucléase 3’-5’?
Les 2 sont dans la paume, mais à 2 endroits distincts
Polymérase = dans le “creux”
À quoi servent les 2 résidus Lys et Arg (2 chambres)?
À stabiliser le pyrophosphate
Quel est le rôle des 4 doigts?
- Rôle dans la présentation de la matrice (interactions hydrophobiques)
- Aident à stabiliser le pyrophosphate avec les résidus Lys et Arg
- Introduisent une rotation de 90 Degrés
Quel est le rôle du pouce de pol I?
Interagit avec l’ADN et réduit le taux de dissociation de pol I
Quel est le rôle de la paume de pol I?
- Proofreading → liens H si les nucléotides sont bien appariés
- Synthèse, car contient le site actif de l’activité polymérase
Comment a-t-il été démontré que l’ADN pol I n’est pas la réplicase?
- Cairns et De Lucia
- Isoler un mutant de Pol I d’E. coli avec moins de 1% de l’activité polymérase sauvage
- Mutant se multipliait à une vitesse normale sans l’activité polymérase
Cairns et De Lucia ont travaillé avec un mutant avec très peu d’activité polymérase. Ce mutant est très sensible aux UV et aux agents mutagènes chimiques. Qu’est-ce que cela suggère?
Suggère que pol I joue un rôle clé dans la réparation d’ADN.
Un brin d’ADN contenant une lésion chimique (endommagé) est souvent clivé du côté…? Qu’est-ce que cela implique?
- 5’
- Active l’activité exonucléase 5’-3’ de pol I → pendant qu’elle excise l’ADN endommagé, pol I comble la brèche grâce à son activité polymérase (resynthèse)
Pol I catalyse le déplacement d’une cassure simple brin ou double brin? Explique
- Simple brin (NICK translation)
- La réaction de déplacement d’une cassure sert à introduire des nucléotides radioactifs dans de l’ADN in vitro → sondes moléculaires en génie génétique
Quel est la fonction physiologique de l’exonucléase 5’-3’ (nick translation) de pol I? Chez E. coli, ce rôle est indispensable pour…?
Enlever les amorces d’ARN
- Comble les trous simple-brin qui en résultent → une ligase lie le tout pour avoir un brin sans brèche
- Indispensable pour la réplication de l’ADN
Vrai ou faux :
L’activité polymérase de pol I requiert une amorce (primer)
Vrai,
en présence de Mg2+
fournit par la primase
Vrai ou faux :
L’activité polymérase (5’-3’) et l’activité exonucléase 5’-3’ surviennent à différents intervalles de temps.
Faux, surviennent simultanément
Qu’est-ce qui permet de discriminer les rNTP des dNTP?
l’extrémité 2’-OH
À part pol I, E. coli possède combien d’autres ADN pol?
4
- pol II, pol III, pol IV et pol V
Quelles ADN pol d’E. coli sont impliquées dans la réparation des lésions d’ADN?
pol II, pol IV et pol V
Vrai ou faux :
L’ADN pol I est la plus abondante.
Vrai
Quelle ADN pol d’E. coli est la réplicase?
Pol III (vitesse de polymérisation = +++++) ***SU alpha est celle active lors de la réplication
Vrai ou faux :
Pol I, II et III sont toutes des ADN pol fidèles.
Vrai, possèdent toutes l’activité polymérase 5’-3’ et l’exonucléase 3’-5’ (proof reading)
Vrai ou faux :
Pol I, II et III possèdent toutes l’activité exonucléase 5’-3’.
Faux, seule pol I la possède
Décrit l’ADN pol III
- Complexe enzymatique de 10 SU différentes
- 900 kDa
- Holoenzyme
Quelle SU de pol III possède l’activité polymérase?
alpha
Quelle SU de pol III possède l’activité exonucléase 3’-5’?
Epsilon → spécificité de l’holoenzyme
Quelle SU de pol III permet l’ordre structural?
Tetha
De quelles SU est composé le site catalytique de pol III?
α, ε et Θ (x2)
Que permet la composante de dimérisation? Quelle SU?
- τ
- Permet de lier les 2 centres catalytiques
Que permet l’attache dimérique? Quelle SU?
- β
- Permet de retenir pol III sur l’ADN et d’augmenter la processivité de l’enzyme (5000 nt)
Que permet le chargeur d’attache? Quelle SU?
- Complexe γ formé de γ, δ, δ’, χ et ψ
- Permet de placer les SU β sur l’ADN (sur les fragments d’Okazaki)
Que permet la forme holomérique de l’enzyme pol III?
Responsable de la très grande processivité de l’enzyme (réplicase)
Comment se forme l’holoenzyme de pol III?
- Complexe γ transfère la SU β à la matrice portant l’amorce → détection des amorces
- Le centre catalytique s’associe avec la SU β de l’ADN (du côté C-terminal de l’anneau)
- Le dimère τ se lie au centre catalytique de la polymérase, permettant à un autre centre catalytique de s’associer.
Pourquoi dit-on que l’holoenzyme de pol III est asymétrique?
Parce qu’il n’y a qu’un seul complexe γ
Toutes les complexes de l’holoenzyme de pol III sont présents en 2 copies sauf 1. Lequel et pourquoi?
Le chargeur d’attache (γ), car il agit seulement sur le brin retardé tandis que les autres agissent sur le brin retardé et le brin avancé.
Quelle forme a le dimère β? L’avantage de cette forme?
- Forme d’anneau fermé autour de l’ADN, forme hexamérique (6 domaines)
- Permet à l’holoenzyme de glisser le long de l’ADN tout en y restant accroché.
Vrai ou faux :
Le dimère β a beaucoup d’interaction avec l’ADN.
Faux, un minimum d’interaction
Qu’est-ce qui explique la grande processivité de l’holoenzyme de pol III?
La structure du dimère β (attache dimérique)
Où se place l’anneau β sur l’ADN?
À l’arrière du site catalytique → β interagit de façon non covalente avec le site catalytique
Avec quoi est couplé le chargement de l’attache β?
Avec la liaison et l’hydrolyse de l’ATP
- Liaison à l’ATP au chargeur d’attache ouvre l’anneau β
- Hydrolyse de l’ATP ferme l’anneau β autour de l’ADN
Qu’est-ce qui compose l’anneau β?
- Extérieur → feuillets β
- Intérieur → hélices α
Que se passe-t-il si les hélices α de l’anneau β sont parallèles au brin d’ADN?
L’interaction avec l’ADN est +++ forte
Vrai ou faux :
Tout comme pol I, l’holoenzyme de pol III peut dérouler le duplex d’ADN
Faux, ne peut pas. Requiert la collaboration de 2 protéines
Quelles protéines doivent collaborer pour permettre le déroulement et la séparation des 2 brins d’ADN parentales avec l’holoenzyme Pol III? Avec quoi est couplé cette activité?
- DnaB
- SSB
→ Collaborent au déroulement de l’ADN et créent la fourche de réplication - Couplée avec l’hydrolyse de l’ATP
Décrit la protéine DnaB et son rôle dans le déroulement de l’ADN.
- Protéine hélicase
- Sépare les brins de l’ADN duplex en se déplaçant le long de la matrice du brin RETARDÉ dans le sens 5’-3’ en hydrolysant l’ATP
Décrit la protéine SSB et son rôle dans le déroulement de l’ADN double brin.
- Protéine affine de l’ADN simple brin
- Se lie aux brins séparés par l’hélicase (DnaB) pour prévenir leur rappariement → stabilise les brins pour pas qu’ils se réassocient
Chez les phages d’E. coli, quelles autres hélicases interviennent dans la réplication de plusieurs ADN?
Rep et PriA, elles se déplacent le long de l’ADN dans le sens 3’-5’ → SE FIXENT AU BRIN AVANCÉ AU LIEU DU BRIN RETARDÉ (hydrolyse de l’ATP)
Rôle de l’ADN ligase?
Ligature (soude) les cassures simple-brin entre les fragments d’Okazaki (+ celle signalant la fin de la réplication du brin avancé d’un ADN circulaire)
ADN ligase : comment la réaction se déroule-t-elle et par quoi est fournie l’énergie requise?
- Réaction se déroule en 3 étapes
1. Enzyme est activée
2. Enzyme cherche les cassures et s’y fixe
3. Enzyme transfère son AMP (attaque nucléophile) pour former un lien phosphodiester entre les 2 fragments - Énergie requise provient du NAD ou de l’ATP → besoin d’activer l’enzyme
Que se passe-t-il si pol I est inhibée et qu’elle ne peut plus enlever les amorces d’ARN?
Sentier alternatif → RNase H
