2.2 Flashcards
načini spreminjanja genoma organizmov
umetni izbor
križanje
genski inženiring
kako deluje umetni izbor?
⇒ človek postopno izbira tiste genotipe in alele, ki so povečali uporabnost gojenega organizma
kaj je navadni postopek umetnega izbora?
v populaciji so raznoliki osebki — tisti, ki nimajo želeno lastnost ne množijo vnaprej, množijo vnaprej le tisti, ki imajo želeno lastnost ⇒ povečanje deleža osebkov z želenimi lastnostmi
kako deluje križanje?
⇒ človek križa sorodne vrste, s katerimi nastanejo alopoliploidi z najbolj zaželenimi lastnostmi
kaj je težava pri križanju?
obstajajo določene naravne omejitve glede možnosti kombiniranja genov različnih vrst zaradi različnega števila in zgradbe kromosomov ⇒ v mejozi nastanejo nepopolne gamete ⇒ potomci so neplodne
kaj je genski inženiring? na čim temelji?
= skupina postopkov, ki omogočajo združitev DNA različnega izvora za neposredno spreminjanje izbranih genov za različne uporabne namene
temelji na univerzalnosti genetskega koda in na razvoju ustreznih molekularno bioloških postopkov
kaj je produkt genskega inženiringa?
gensko spremenjeni organizmi (GSO) = organizmi (z izjemo človeka), ki smo jim z vnosom tuje DNA spremenili genom na način, ki se ne pojavlja v naravi s križanjem in/ali naravno rekombinacijo
kaj so glavni koraki genskega inženiringa?
- izolacija enega gena iz izvornega genoma ⇒ dobimo DNA brez proteinov
- izrez želenega dela DNA s pomočjo restrikcijskih encimov
- izolacija fragmenta DNA
- priprava in uporaba vektorja za kloniranja: restrikcijski encim izreže plazmid, v odprt plazmid se vstavi želeni gen s pomočjo encima ligaze
- genetsko spremenjeni plazmid se vstavi v gostiteljski organizem in se v njem klonira
organizme lahko genetsko spreminjamo na tri načine:
- dodatek tujega gena ⇒ transgeni organizmi
- sprememba obstoječega gena
- odstranitev, deaktivacija obstoječega gena
primeri GS bakterije
Somatostatin = hGH (človeški rastni hormon), čiščenje onesnaženega okolja
o hGH
nastaja v hipofizi
gre za kratek protein, ki je sestavljen s 14 aminokislinami
pospeši rast telesnih, mišic in kostnih celic
kako hGH pospeši rast telesnih, mišičnih in kostnih celic?
pospeši sintezo proteinov
pospeši privzem aminokislin preko celične membrane
pospeši pretvorbo glikogena v glukozo v jetrih
katera bakterija se uporablja za genetski inženiring GS bakterij? zakaj?
mutirana različica E.coli
ker obstaja nevarnost, da bi genetsko spremenjena bakterija lahko ušla v okolje in izmenjala svoje gene s populacijo E.coli iz črevesja ⇒ možne so nepredvidljive posledice
kje gojijo mutirane E.coli?
v bioreaktorjih v biotovarnah
zakaj je spreminjanje genov v evkariontih bolj zahtevno kot pri prokariontih?
plazmidi niso prisotni (razen v kvasovkah)
vstavljeni plazmidi težko preživijo v evkariontskih celicah
evkarionti so diploidni ⇒ pri genskem inženiringu morata biti spremenjeni dva alela
kaj je bila prva transgena žival?
ovčka Tracy, ki je v svojem mleku tvorila rekombinantno zdravilo AAT
kaj je AAT? kakšno vlogo ima v človeškem telesu?
= alfa-1-antitripsin = beljakovinsko zdravilo za zdravljenje emfizema in cistične fibroze
vzdržuje elastičnost pljuč – ključna za dihalne gibe
postopki genetskega spreminjanja ovčke Tracy?
človeški gen AAT so spojili s promoterskim genom za β-laktoglobulin ⇒ vstavili rekombinantne DNA v jedro ovčje jajčece ⇒ implantacija jajčece v ovco ⇒ izražanje človeškega AAT je omejeno na mlečne žleze ⇒ AAT se izloča v mleko ⇒ pridobivanje mleka iz transgenih živali ⇒ ločevanje mlečnih beljakovin (ki vključuje človeški AAT) ⇒ dobivanje AA
zakaj je rastlin lažje genetsko spreminjati kot živali?
večino rastlin lahko iz ene same somatske celice vzgojimo celotno rastlino
kaj je postopek tvorjenja transgenih rastlin?
bakterija se veže na rastlinsko celico ⇒ Ti DNA se prenese v rastlinsko celico, nato v jedro, kjer se Ti plazmid vstavi v rastlinski genom ⇒ rastlinska celica izrazi bakterijske Ti gene, proizvaja proteine, ki jih ti kodirajo ⇒ željeno rastlino okužimo s spremenjeno bakterijo ⇒ vzgojimo rastlino, ki vsebuje želene gene
kaj je Ti plazmid?
DNA plazmid bakterije Agrobacterium tumefaciens, ki povzroča tvorbo tumorjev
kaj so restrikcijski encimi? kakšno vlogo imajo? kako so poimenovani?
režejo DNA na specifičnih zaporedjih nukleotidov, oz. odprejo plazmide in izrežejo izbrani gen iz večje molekule DNA različnih bakterij
imajo obrambno vlogo proti tuji DNA v bakterijah tako, da uničijo virusno DNA
poimenovani so glede na vrste bakterij, iz katerih so jih prvič izolirali
kaj je kloniranje?
= proizvodnja identičnih kopij genov, celic ali organizmov
kaj je klon?
= produkt kloniranja = skupina genetsko identičnih organizmov/celic, nastalih iz ene same starševske celice
kaj je gensko kloniranje?
= proizvodnja številnih kopij enega samega gena
kako lahko uporabimo gensko kloniranje?
za izdelavo številnih kopij določenega gena
za proizvodnjo proteinskega produkta
kakšen je postopek kloniranja bakterij?
- izolacija plazmida bakterijske celice in vanj vstavijo DNA iz drugega organizma ⇒ nastane rekombinantni plazmid
- rekombinantni plazmid vrnejo v bakterijsko celico ⇒ bakterija postane rekombinantna bakterija
- rekombinantna bakterija se razmnožuje z delitvijo ⇒ nastane klon bakterij
kako lahko kloniramo rastline? + primeri
večino rastlin je mogoče enostavno klonirati iz koščka korenine, stebla ali listov
pritlike jagod, gomolji ter čebulice in potaknjenci
s katero tehniko lahko kloniramo živali? kako imenujemo nastale embrije?
s tehniko prenosa jedra
= nadomestitev jedra neoplojene jajčne celice z jedrom iz diferencirane odrasle telesne celice ⇒ nastane klon telesne celice
embrije, ki so nastale s tehniko prenosa jedra = blastociste
kaj omogoča tehniko prenosa jedra?
v citoplazmi neoplojene jajčne celice so snovi, ki povzročajo delitev celic
kdaj uporabljamo reproduktivno kloniranje? kaj je najbolj znan primer uspešnega reproduktivnega kloniranja?
ko organizem ima določene želene lastnosti in si želimo več organizmov s takimi lastnostmi
ovčka Dolly
kaj je bil postopek kloniranja ovčke Dolly?
- prenos jedra iz telesne celice — eno jedro iz celic mlečnih žlez, ki so že diferencirane, 6-letne ovce so prenesli v citoplazmo prazne neoplojene jajčne celice
- pod vplivom proteinov iz jajčne citoplazme, se je odrasli genom reprogramiral tako, da se je začel razvoj zarodka
- zarodek na ravno blastociste so prenesli v maternico nadomestne matere, ki je nosila zarodek in omogočila njegov skotitev
v kakšni genetski povezavi sta blastocista in nadomestna mater? kaj pa blastocista in žival, od katere so vzeli jedro?
ni genetske povezave med nadomestno materjo in zarodkom
genom kloniranje živali je enaki tistemu, od živali, od katere so vzeli jedro
kaj je terapevtsko kloniranje?
= proizvodnja zarodkov za preskrbo z embrionalnimi zarodnimi celicami za medicinsko uporabo (proizvodnja kože ali drugih tkiv)
kaj je postopek terapevtskega kloniranja po SCNT?
- jedro jajčne celice je odstranjeno in ga nadomesti jedro somatske celice od specifičnega donorja ⇒ ta celica se pretvori v klonirano blastocisto
- zarodna celica iz klonirane blastociste lahko razvije v katerokoli vrsto človeških celic, ki genetsko ujemajo k določenemu donorju
kaj je razlika med postopkoma reproduktivnega in terapevtskega kloniranja?
zarodki nikoli ne vstavijo v maternico pri terapevtskem
kaj je genska terapija?
= vnos DNA v človeške/živalske celice z namenom nadomestiti, spremeniti ali utišati izražanje okvarjenega gena
kako poteka genska terapija?
- povezava DNA, ki jo želimo vnesti, z vektorjem
- poteka na dva načina:
a. odvzem celice ⇒ vnos DNA v celico ex vivo ⇒ gensko spremenjeno celico vrnejo nazaj v organizem
b. vnos DNA direktno v celice okvarjenih tkiv in organov
kateri bolezni se zdravijo z gensko terapijo?
SCID, spinalna mišična atrofija
kaj je SCID?
huda kombinirana imunska pomanjkljivost, ki je posledica okvarjenega gen ADA na kromosomu 20, kodira encim adenozin deaminaza ⇒ nefunkcionalen imunski sistem
koraki genske terapije za SCID
- izolacija limfocitov z okvarjenim genom ADA iz bolnika s SCID
- gojenje teh celic “in vitro”
- vnos retrovirusa z genom, ki kodira delujoč encim ADA “ex vivo” v nagojene limfocite
- transfuzija modificiranih limfocitov nazaj v bolnika
kaj je spinalna mišična atrofija?
posledica okvarjenega ali manjkajočega gena SMN1 ⇒ napredujoča mišična oslabelost
kaj je PCR? kdaj je uporaben?
= metoda, s katero lahko v epruveti v nekaj urah večmilijonkrat pomnožimo določen odsek DNA
uporaben pri majhni količini DNA, nečistih vzorci DNA
postopek PCR:
- denaturacija DNA
- vezava začetnih primerjev
- sinteza komplementarne verige
- ponovitev n krat ⇒ nastanek 2n molekul DNA
to kar potrebujemo za PCR:
tarčno zapordje DNA
Taq DNA polimeraza
MgCl2
PCR pufer
2 primerja
prosti DNA nukleotidi
kaj je Taq DNA polimeraza?
= encim, ki katalizira polimerizacijo DNA nukleotidov v polinukleotidno verigo DNA
kaj je MgCl2?
= ključni kofaktor za delovanje Taq DNA polimeraze
kaj dela PCR pufer?
ustvarja optimalno okolje za delovanje Taq DNA polimeraze
kaj je primer za PCR? zakaj potrebujemo 2?
= kratka enoverižna zaporedje DNA nukleotidov, ki so ustvarjeni tako, da locirajo tarčno DNA zaporedje
potrebujemo dva primerja za pomnožitev tarčnega zaporedja: en, ki se veže na začetek, drugi pa na konec tarčnega zaporedja
kaj so prednosti PCR?
hitrost, specifičnost
kaj je PCR v realnem času? na čim temelji?
spremlja nastajanje produkta med samo reakcijo, opazuje in izmeri kako reakcija napreduje
temelji na spremljanju fluorescentnega signala ⇒ poleg dveh začetnih primerjev potrebujemo še fluorescenčne barvila/probe, ki se specifično vežejo na komplementarno molekulo DNA
oddana fluorescenca v vsakem PCR ciklu je sorazmerna količini nastalega produkta
kaj so faze PCR-ja v realnem času?
- background faza (signala ne moremo zaznati, zato ne moremo meriti količino produkta)
- eksponencialna faza (količina produkta raste eksponencialno)
- faza platoja (produkt ne nastaja več zaradi prebitka produkta glede na primerje)
kaj je Ct? mejna črta
Ct = cikel, v katerem količina produkta naraste dovolj, da signal lahko detektiramo pri PCR = začetek eksponencialne faze
mejna črta = jakost, pri kateri odčitamo Ct vrednost na grafu
kako poteka PCR v realnem času s fluorescenčnim barvilom?
barvilo, ki ni vezano na dvojno verigo DNA, ne fluorescira, ampak ko se barvilo veže na dvojno vijačnico, začne emitirati fluorescenco ⇒ omogoča določitev začetne koncentracije DNA v vzorcu
kako poteka PCR v realnem času s probo?
probe imajo vezane reportersko barvilo in barvilo dušilca — reportersko barvilo samo zase fluorescira, a ker je v bližini barvila dušilca, ta zaduši fluorescenco
DNA polimeraza med podaljševanjem polinukleotidne verige cepi probo ⇒ ločevanje reporterskega barvila in barvila dušilca ⇒ reportersko barvilo začne oddajati fluorescenco
postopek coronavirus testa?
- izolacija virusne RNA
- sinteza cDNA verige, ki je komplementarna virusni RNA, z encimom reverzna transkriptaza
- denaturacija (razprtje dvojne verige RNA-cDNA)
- vezava primerjev
- sinteza komplementarne verige k cDNA z DNA polimerazo
- pridobitev tarčnega zaporedja: denaturacija in vezava primerjev s TaqMan probe
- DNA polimeraza med podaljševanjem polinukleotidne verige cepi probo ⇒ loči reportersko barvilo od dušilca ⇒ začne oddajati fluorescenco
kaj je gelska elektroforeza?
= metoda za analizo DNA, ki se uporablja za ločevanje proteinov ali delov DNA, glede na njihovo velikost, električni naboj ali druge fizikalne lastnosti
kako deluje gel pri elektroforezi?
gel je polimer, ki deluje kot molekularno sito za ločevanje nukleinskih kislin ali proteinov glede na njihove fizikalne lastnosti
makromolekule se ločijo glede na njihovo hitrost premikanja skozi gel v električnem polju — razdalja, ki jo prepotuje molekula DNA, je obratno sorazmerna z njeno dolžino
nukleinske kisline imajo negativen naboj zaradi fosfatne skupine ⇒ potujejo proti pozitivnemu polu električnega polja
kaj je genetski profil? + primer
= edinstveno DNA zaporedje vsakega posameznika (npr. prstni odtis)
kaj so mikrosatelitska zaporedja? kako se razlikujejo med ljudmi?
ali STR = zaporedja iz 2 do 6 baznih parov
število ponovitev teh zaporedij se od človeka do človeka močno razlikuje
te ponovitve obstajajo na obeh alelih homolognih kromosomov
kaj so postopki primerjav genetskih profilov? + primer
- pridobitev vzorca DNA
- s PCR se pomnožijo specifične STR v vzorcu DNA
- gelska elektroforeza ⇒ ugotovimo velikost pomnoženega zaporedja DNA in števila ponovitev zaporedja STR
- primerjamo DNA profili več posameznikov
npr: določanje očetovstva
na kaj se nanašajo evolucijske raziskave?
- filogeneza
- filogenetske spremembe
- vzroki za takšne spremembe
- mehanizmi evolucije
kaj je prva znanstvena hipoteza o evoluciji?
Lamarckova hipoteza, da so dolgovrati potomci žirafov, ki lahko sežejo do šest metrov višine, posledica iztegovanja in dedovanja te lastnosti skozi več generacij