2) purification partie 2 Flashcards
principe de base par échange d’ions
interaction entre des ions de charges opposées
2 formes de base de chromatographie par échange d’ions
- chromatographie par échange de cations (charge négative sur résine)
- chromatographie par échange d’anions (charge positive sur résine)
effet augmentation de la charge nette de la molécule?
augmente l’adsorption à la résine
étapes de désorption?
- diminuer la charge nette par changement de pH
2. augmenter [ions compétitifs] (ex: NaCl ou KCl)
effet augmentation de la charge nette de la protéine?
besoin d’augmenter [sels] nécessaire pour désorption
acides aminés jouent un rôle important dans chromatographie e.i
quand il y a une protéine avec un excès de charge positive, tout le pH < ou > pI?
pH < pI => accès charge positive
intervalle de point isoélectrique pour un excès de charge positive?
6 < pI < 9 (pareil que le pH)
type d’échange d’une résine avec charge positive et protéine charge négative
échangeur d’anions
1ère étape de chromatographie par échange d’ions
équilibration (avec tampon)
2e étape de chromatographie par échange d’ions
application de l’échantillon
protéines de la même charge que la résine sortent de la colonne en premier (pcq pas liées)
3e étape de chromatographie par échange d’ions
élution par gradient (ordre CROISSANT de la charge nette pour sortie; 1 sort en premier…)
4e étape de chromatographie par échange d’ions
régénérationi
3 types d’échange?
- anion fort
- cation fort
- anion faible
conséquence petite colonne (sur débit)?
débit plus lent
conséquence grosse colonne (sur débit)?
débit + vite
avantages chromatographie par échange d’ions
- méthode FLEXIBLE (sel et pH)
- choix entre échangeur cationique et anionique (faible/fort)
- bcp de résines différentes
- résines pas chères
- purification possible avec des détergents sans charge en présence d’urée
limites chromatographie par échange d’ions
- méthode =/= spécifique
- on ne peut PAS utiliser le dénaturant guanidine pcq il est chargé
- besoin de 2 pompes pour performance optimale (FPLC)
sur quoi se base la séparation pour chromatographie par filtration sur gel?
sur la taille moléculaire sur protéine d’intérêt
V/F: les gels sont poreux et les protéines pénètrent dans les gels
VRAI -> les gels sont sélectifs pour la taille moléculaire
endroit de partition des protéines?
entre la phase mobiel et phase stationnaire
signification pénétration entre 20-100 kDa?
- protéines t.m > 100 kDa => pas de pénétration dans pores (pas de séparation)
- protéines t.m < 20 kDa => pas de pénétration
+ gros ou + petit sortent tous ensemble
1e étape de chromatographie par filtration sur gel
équilibration avec tampon
2e étape de chromatographie par filtration sur gel
application de l’échantillon
- moins il y a de protéines -> plus facile de diminuer le volume (meilleure résolution)
3e étape de chromatographie par filtration sur gel?
élution -> plus grosse protéines sortent en 1er pcq pas accès aux pores …
V/F: il y a une étape de régénération pour la chromatographie par filtration sur gel
FAUX pcq utilise même tampon
V/F: plus la colonne est longue, plus il y a de filtration sur gel
VRAI
avantages chromatographie par filtration sur gel
- bcp de résines différentes (taille particules, écart de séparation)
- résines =/= chères
- purification possible avec détergents et en présence de dénaturants (sans ou avec charges)
- bonne méthode pour purification protéines dans les corps d’inclusion
- équipement =/= cher, possible avec élution linéaire
limites chromatographie par filtration sur gel
- chromatographie =/= bonne pour purifier grandes quantités de protéines pcq important de minimiser volume
- résines =/= très résistantes ni très durables
- vitesses d’écoulement (flow rates) = FAIBLES
sur quoi se base la séparation en chromatographie en phase inverse?
sur les interactions hydrophobes
principe chromatographie en phase inverse
désorption de protéines avec solvant organique
quelle étape de purification la chromatographie en phase inverse est-elle bonne?
3e : Polir - retirer petites impuretés
V/F: l’adsorption de protéines est en équilibre réversible
VRAI -> varie selon le changement de polarité du solvant
1e étape de chromatographie en phase inverse
équilibration avec tampon
2e étape de chromatographie en phase inverse
application de l’échantillon
3e étape de chromatographie en phase inverse
élution (par gradient => augmentation [solvant organique])
molécule - hydrophobe sort en premier
effet augmentation [solvant organique] ?
protéine peu hydrophobe sort de la colonne en 1er
4e étape de chromatographie en phase inverse
régénération (hydrophobes sortent en dernier)
effet augmentation longueur de colonne sur chromatographie en phase inverse
+ la colonne est hydrophobe
avantages chromatographie en phase inverse
- pls types résines donnant BONNE résolution
- bon pour purification protéines dans corps d’inclusion
- résines = RÉSISTANTES et DURABLES
- vitesses d’écoulement = VARIÉES (faible à forte vitesse)
limites chromatographie en phase inverse
- colonnes = $$$
- pas bon pour toutes protéines (spécialement grosses et protéines trop hydrophobes)
- peut entraîner dénaturation de la protéine d’intérêt
- équipement = $$$ (HPLC)
vérification identité protéine par quelle méthode?
spectrométrie de masse : PRÉCISE et SENSIBLE, mais équipement $$$
méthodes standards pour synthèse ARN
- synthèse chimique
2. synthèse enzymatique in vitro avec ARN polymérase du bactériophage T7
avantages méthodes standard pour purification ARN (par gel d’électrophorèse dénaturant)
- BONNE résolution
- pas d’instruments de chromatographie
- purification grosses quantités ARN (pls mg)
limites méthodes standards pour purification ARN
- long et ennuyeux/pénible
- dénature ARN de façon systématique
- contamination avec oligomères d’acrylamide
méthode utilisée pour maximiser rendement et pureté ARN produit
purification par affinité avec ARiBo-Tag
1e étape purification par affinité avec ARiBo-Tag
transcription in vitro ARN fusionnée à ARiBo
2e étape purification par affinité avec ARiBo-Tag
immobilisation ARN
3e étape purification par affinité avec ARiBo-Tag
auto-clivage avec GlcN6P et élution ARN
