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BCM2501 - Macromolécules > 2) purification partie 2 > Flashcards

2) purification partie 2 Flashcards

1
Q

principe de base par échange d’ions

A

interaction entre des ions de charges opposées

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2
Q

2 formes de base de chromatographie par échange d’ions

A
  1. chromatographie par échange de cations (charge négative sur résine)
  2. chromatographie par échange d’anions (charge positive sur résine)
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3
Q

effet augmentation de la charge nette de la molécule?

A

augmente l’adsorption à la résine

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4
Q

étapes de désorption?

A
  1. diminuer la charge nette par changement de pH

2. augmenter [ions compétitifs] (ex: NaCl ou KCl)

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5
Q

effet augmentation de la charge nette de la protéine?

A

besoin d’augmenter [sels] nécessaire pour désorption

acides aminés jouent un rôle important dans chromatographie e.i

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6
Q

quand il y a une protéine avec un excès de charge positive, tout le pH < ou > pI?

A

pH < pI => accès charge positive

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7
Q

intervalle de point isoélectrique pour un excès de charge positive?

A

6 < pI < 9 (pareil que le pH)

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8
Q

type d’échange d’une résine avec charge positive et protéine charge négative

A

échangeur d’anions

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9
Q

1ère étape de chromatographie par échange d’ions

A

équilibration (avec tampon)

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10
Q

2e étape de chromatographie par échange d’ions

A

application de l’échantillon

protéines de la même charge que la résine sortent de la colonne en premier (pcq pas liées)

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11
Q

3e étape de chromatographie par échange d’ions

A

élution par gradient (ordre CROISSANT de la charge nette pour sortie; 1 sort en premier…)

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12
Q

4e étape de chromatographie par échange d’ions

A

régénérationi

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13
Q

3 types d’échange?

A
  1. anion fort
  2. cation fort
  3. anion faible
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14
Q

conséquence petite colonne (sur débit)?

A

débit plus lent

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15
Q

conséquence grosse colonne (sur débit)?

A

débit + vite

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16
Q

avantages chromatographie par échange d’ions

A
  • méthode FLEXIBLE (sel et pH)
  • choix entre échangeur cationique et anionique (faible/fort)
  • bcp de résines différentes
  • résines pas chères
  • purification possible avec des détergents sans charge en présence d’urée
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17
Q

limites chromatographie par échange d’ions

A
  • méthode =/= spécifique
  • on ne peut PAS utiliser le dénaturant guanidine pcq il est chargé
  • besoin de 2 pompes pour performance optimale (FPLC)
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18
Q

sur quoi se base la séparation pour chromatographie par filtration sur gel?

A

sur la taille moléculaire sur protéine d’intérêt

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19
Q

V/F: les gels sont poreux et les protéines pénètrent dans les gels

A

VRAI -> les gels sont sélectifs pour la taille moléculaire

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20
Q

endroit de partition des protéines?

A

entre la phase mobiel et phase stationnaire

21
Q

signification pénétration entre 20-100 kDa?

A
  • protéines t.m > 100 kDa => pas de pénétration dans pores (pas de séparation)
  • protéines t.m < 20 kDa => pas de pénétration
    + gros ou + petit sortent tous ensemble
22
Q

1e étape de chromatographie par filtration sur gel

A

équilibration avec tampon

23
Q

2e étape de chromatographie par filtration sur gel

A

application de l’échantillon

- moins il y a de protéines -> plus facile de diminuer le volume (meilleure résolution)

24
Q

3e étape de chromatographie par filtration sur gel?

A

élution -> plus grosse protéines sortent en 1er pcq pas accès aux pores …

25
Q

V/F: il y a une étape de régénération pour la chromatographie par filtration sur gel

A

FAUX pcq utilise même tampon

26
Q

V/F: plus la colonne est longue, plus il y a de filtration sur gel

A

VRAI

27
Q

avantages chromatographie par filtration sur gel

A
  • bcp de résines différentes (taille particules, écart de séparation)
  • résines =/= chères
  • purification possible avec détergents et en présence de dénaturants (sans ou avec charges)
  • bonne méthode pour purification protéines dans les corps d’inclusion
  • équipement =/= cher, possible avec élution linéaire
28
Q

limites chromatographie par filtration sur gel

A
  • chromatographie =/= bonne pour purifier grandes quantités de protéines pcq important de minimiser volume
  • résines =/= très résistantes ni très durables
  • vitesses d’écoulement (flow rates) = FAIBLES
29
Q

sur quoi se base la séparation en chromatographie en phase inverse?

A

sur les interactions hydrophobes

30
Q

principe chromatographie en phase inverse

A

désorption de protéines avec solvant organique

31
Q

quelle étape de purification la chromatographie en phase inverse est-elle bonne?

A

3e : Polir - retirer petites impuretés

32
Q

V/F: l’adsorption de protéines est en équilibre réversible

A

VRAI -> varie selon le changement de polarité du solvant

33
Q

1e étape de chromatographie en phase inverse

A

équilibration avec tampon

34
Q

2e étape de chromatographie en phase inverse

A

application de l’échantillon

35
Q

3e étape de chromatographie en phase inverse

A

élution (par gradient => augmentation [solvant organique])

molécule - hydrophobe sort en premier

36
Q

effet augmentation [solvant organique] ?

A

protéine peu hydrophobe sort de la colonne en 1er

37
Q

4e étape de chromatographie en phase inverse

A

régénération (hydrophobes sortent en dernier)

38
Q

effet augmentation longueur de colonne sur chromatographie en phase inverse

A

+ la colonne est hydrophobe

39
Q

avantages chromatographie en phase inverse

A
  • pls types résines donnant BONNE résolution
  • bon pour purification protéines dans corps d’inclusion
  • résines = RÉSISTANTES et DURABLES
  • vitesses d’écoulement = VARIÉES (faible à forte vitesse)
40
Q

limites chromatographie en phase inverse

A
  • colonnes = $$$
  • pas bon pour toutes protéines (spécialement grosses et protéines trop hydrophobes)
  • peut entraîner dénaturation de la protéine d’intérêt
  • équipement = $$$ (HPLC)
41
Q

vérification identité protéine par quelle méthode?

A

spectrométrie de masse : PRÉCISE et SENSIBLE, mais équipement $$$

42
Q

méthodes standards pour synthèse ARN

A
  1. synthèse chimique

2. synthèse enzymatique in vitro avec ARN polymérase du bactériophage T7

43
Q

avantages méthodes standard pour purification ARN (par gel d’électrophorèse dénaturant)

A
  • BONNE résolution
  • pas d’instruments de chromatographie
  • purification grosses quantités ARN (pls mg)
44
Q

limites méthodes standards pour purification ARN

A
  • long et ennuyeux/pénible
  • dénature ARN de façon systématique
  • contamination avec oligomères d’acrylamide
45
Q

méthode utilisée pour maximiser rendement et pureté ARN produit

A

purification par affinité avec ARiBo-Tag

46
Q

1e étape purification par affinité avec ARiBo-Tag

A

transcription in vitro ARN fusionnée à ARiBo

47
Q

2e étape purification par affinité avec ARiBo-Tag

A

immobilisation ARN

48
Q

3e étape purification par affinité avec ARiBo-Tag

A

auto-clivage avec GlcN6P et élution ARN

BCM2501 - Macromolécules (4 decks)

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