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BCM2501 - Macromolécules > 1) expression et purification des protéines > Flashcards

1) expression et purification des protéines Flashcards

1
Q

localisation des protéines dans la cellule?

A
  • membrane
  • noyau
  • cytoplasme
  • réticulum endoplasmique
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Q

caractéristiques physico-chimiques de la protéine?

A
  • taille moléculaire
  • point isoélectrique
  • glycosylation, phosphorylation et méthyldation : modifications protéines
  • liaison avec métal ou ligand ou cofacteur
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3
Q

sources de protéines les plus communes?

A
  1. tissus animaux
  2. bactéries (E.coli)
  3. levures (Pichia pastoris)
  4. cellules d’insectes (Sf9)
  5. cellules humaines (HEK 293-E6)
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4
Q

avantages isolation de protéines de tissus animaux?

A
  • protéine native
  • modifications post-traductionnelles
  • pas cher
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Q

limites isolation de protéines de tissus animaux?

A
  • sources limitées
  • petite quantité de protéines spécifiques
  • pas d’étiquette (tag spécial)
  • pas toujours reproductible
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6
Q

avantages expression de protéines dans bactérie?

A
  • beaucoup de protéines et milieux pas chers => purification facile
  • rapide culture et expression
  • bcp de vecteurs d’expression différents (tags/étiquettes)
  • l’expression de protéines marquées est facile (RMN et rayons-X)
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7
Q

limites expression de protéines dans bactérie?

A
  • pas de modifications post-traductionelles ou ponts disulfures
  • pas bon pour protéines membranaires
  • différents codons chez bactérie (problème de codons rares) => ARNt différent
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8
Q

avantages expression de protéines dans levure?

A
  • bcp de protéines et milieux pas chers
  • ponts disulfures et certaines modifications post-traductionnelles (phosphorylation)
  • expression des protéines marquées est possible (RMN)
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9
Q

limites expression de protéines dans levure?

A
  • moins rapide vs bactérie
  • différents codons chez levure
  • pas bonne pour les protéines glycosylées (pas glycosylation)
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10
Q

avantages expression de protéines chez l’insecte?

A
  • ponts disulfures et modifications post-traductionnelles
  • très bon pour protéines glycosylées
  • vecteurs avec His-tag
  • meilleurs codons - bon pour les grosses protéines humaines (+ précis vs humains)
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11
Q

limites expression de protéines chez l’insecte?

A
  • pas rapide et moins de protéine -> masse faible chez insecte
  • production baclovirus et infection
  • milieux spéciaux (+ chers)
  • production protéines marquées est difficile
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12
Q

avantages expression dans cellules humaines?

A
  • ponts disulfures, modifications post-traductionnelles et protéines membranaires
  • protéines contaminantes =/= immunogènes
  • vecteur de production avec His-tag
  • codons parfaits - meilleur choix pour GROSSES protéines humaines
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13
Q

limites expression dans cellules humaines?

A
  • pas rapide et moins de protéine -> - cell/volume => masse faible
  • besoin fermenter pour grosse production
  • milieux spéciaux (+ chers)
  • production de protéines marquées est impossible
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14
Q

méthodes de choix pour petites protéines ou domaines - bactérie?

A

pas d’expression -> optimisation codons : insectes ou humaines

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15
Q

méthodes de choix pour petites protéines ou domaines avec ponts disulfure - levure?

A

pas d’expression -> optimisation codons : insectes ou humaines

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16
Q

méthodes de choix pour protéines membranaires?

A

insectes ou humaines

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17
Q

méthodes de choix pour grosses protéines humaines?

A

insectes ou humaines

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18
Q

méthodes de choix pour protéines marquées?

A

bactérie (RMN ou X-Ray) ou levure (RMN)

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19
Q

méthodes de choix pour applications thérapeutiques?

A

humaines

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20
Q

1ère étape de purification pour protéines solubles?

A

capturation : isoler et concentrer

  • précipitation saline
  • chromatographie d’affinité
  • chromatographie par échange d’ions
21
Q

2e étape de purification pour protéines solubles?

A

purification : retirer grosses impuretés

  • chromatographie d’affinité
  • chromatographie par échange d’ions
22
Q

3e étape de purification pour protéines solubles?

A

polir: retirer petites impuretés (comme protéases)
- chromatographie par filtration sur gel
- chromatographie en phase inverse

23
Q

chromatographie en Urée pour corps d’inclusion?

A
  1. chromatographie par échange d’ions (DIFFÉRENCE ENTRE URÉE ET GUANI.)
  2. chromatographie d’affinité His-tag
  3. chromatographie par filtration sur gel
24
Q

chromatographie en Guanidinium pour corps d’inclusion?

A
  1. chromatographie d’affinité His-tag

2. chromatographie par filtration sur gel

25
Q

intervalle de pH pour tampons pour purification

A

6 < pH < 9 pcq stabilité

26
Q

conséquence augmentation de sels (sulfate d’ammonium) dans la précipitation saline de protéines?

A

diminution de solubilité pcq en augmentant le sels -> on augmente la liaison hydrophobe-hydrophobe

27
Q

méthodes chromatographie des protéines communes?

A
  1. chromatographie d’affinité
  2. chromatographie par échange d’ions
  3. chromatographie par filtration sur gel
  4. chromatographie en phase inverse
28
Q

types de chromatographie?

A
  • FPLC : pression moyenne

- HPLC : pression haute

29
Q

nombre de tampon pour élution linéaire?

A

1

- séparation - efficace même si protocole facile

30
Q

nombre de tampon pour élution par gradient?

A

2 ou plus

- séparation + efficace même si protocole compliqué

31
Q

caractéristiques détection du signal aux ultraviolets (UV)?

A
  • loi Beer-Lambert : absorbance proportionnelle à concentration
32
Q

filtres UV les plus importants pour des protéines?

A
  • 214 ou 228 nm: + sensible -> détecte groupes amides des aa
  • 254 nm : - sensible -> détecte seulement le noyau aromatique Phe, Tyr et Trp
  • 280 nm : détecte seulement noyau aromatique de Tyr et Trp (absorption + forte)
33
Q

caractéristiques de chromatographie d’affinité?

A
  • liaison spécifique entre protéine et résine qui est facilement réversible
  • propriété biochimique unique de la protéine d’intérêt
  • BONNE méthode pour 2 premières étapes purification
34
Q

exemples chromatographie d’affinité?

A
  1. protéines natives avec propriété biochimique unique pour ligand
  2. protéines de fusion formant liaison avec ligand
35
Q

ligand de la protéine de fusion Glutathion-S-transférase (GST)?

A

glutathion

36
Q

ligand de la protéine de fusion attache-(His)_6?

A

Nickel (Ni^2+)

37
Q

type de liaison résine avec ligand d’affinité?

A

liaison covalente (stable)

38
Q

fonction bras espaceur pour résine d’affinité?

A

minimiser la liaison avec la matrice et les protéines

39
Q

1ère étape chromatographie d’affinité?

A

étape d’équilibration

40
Q

2e étape chromatographie d’affinité?

A

étape de liaison

41
Q

3e étape chromatographie d’affinité?

A

étape d’élution

42
Q

avantages fusion de GST (chromatographie d’affinité)

A
  • augmente solubilité de la protéine
  • purification facile avec résine glutathion
  • élution facile avec petit ligand (glutathion) -> stable et pas cher
43
Q

désavantages fusion de GST (chromatographie d’affinité)

A
  • grosse étiquette/tag
  • purification =/= possible avec dénaturants -> GST = protéine avec SLM conformation native (pas liaison entre glutathion et notre protéine)
  • GST forme un dimère -> pas bons pour essais biologiques -> doit enlever tag-GST avec protéases
44
Q

V/F: il est possible de cliver la protéine de fusion après la purification

A

VRAI -> site de coupure normalement inclus dans le vecteur sélectionné
Donc, vérifier qu’il n’y a pas de site de coupure pour la protéase de notre choix dans protéine

45
Q

3 protéases les plus populaires?

A
  1. thrombine
  2. facteur Xa
  3. TEV (Tobacco Etch Virus - protéase de mosaïque du tabac)
46
Q

avantages fusion poly-histidine

A
  • purification facile avec résine de nickel
  • élution facile avec petit ligand (imidazole)
  • purification possible avec détergents et dénaturants
  • petite étiquette/tag (6 aa)
47
Q

désavantages fusion poly-histidine

A
  • augmente formation de corps d’inclusion
  • purification =/= possible avec antioxydants comme DTT
  • pas bon pour purification protéines liant métaux de transition
48
Q

propriétés essentielles pour le compétiteur?

A
  • liaison spécifique, mais aussi liaison facilement réversible (avec résine ou tag)
  • stable chimiquement et interne (pas réactif)
  • pas trop cher
  • petite taille moléculaire : séparation par dialyse après purification

BCM2501 - Macromolécules (4 decks)

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