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BCM2501 - Macromolécules > 1) expression et purification des protéines > Flashcards

1) expression et purification des protéines Flashcards

1
Q

localisation des protéines dans la cellule?

A
  • membrane
  • noyau
  • cytoplasme
  • réticulum endoplasmique
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Q

caractéristiques physico-chimiques de la protéine?

A
  • taille moléculaire
  • point isoélectrique
  • glycosylation, phosphorylation et méthyldation : modifications protéines
  • liaison avec métal ou ligand ou cofacteur
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3
Q

sources de protéines les plus communes?

A
  1. tissus animaux
  2. bactéries (E.coli)
  3. levures (Pichia pastoris)
  4. cellules d’insectes (Sf9)
  5. cellules humaines (HEK 293-E6)
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4
Q

avantages isolation de protéines de tissus animaux?

A
  • protéine native
  • modifications post-traductionnelles
  • pas cher
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Q

limites isolation de protéines de tissus animaux?

A
  • sources limitées
  • petite quantité de protéines spécifiques
  • pas d’étiquette (tag spécial)
  • pas toujours reproductible
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6
Q

avantages expression de protéines dans bactérie?

A
  • beaucoup de protéines et milieux pas chers => purification facile
  • rapide culture et expression
  • bcp de vecteurs d’expression différents (tags/étiquettes)
  • l’expression de protéines marquées est facile (RMN et rayons-X)
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7
Q

limites expression de protéines dans bactérie?

A
  • pas de modifications post-traductionelles ou ponts disulfures
  • pas bon pour protéines membranaires
  • différents codons chez bactérie (problème de codons rares) => ARNt différent
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8
Q

avantages expression de protéines dans levure?

A
  • bcp de protéines et milieux pas chers
  • ponts disulfures et certaines modifications post-traductionnelles (phosphorylation)
  • expression des protéines marquées est possible (RMN)
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9
Q

limites expression de protéines dans levure?

A
  • moins rapide vs bactérie
  • différents codons chez levure
  • pas bonne pour les protéines glycosylées (pas glycosylation)
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10
Q

avantages expression de protéines chez l’insecte?

A
  • ponts disulfures et modifications post-traductionnelles
  • très bon pour protéines glycosylées
  • vecteurs avec His-tag
  • meilleurs codons - bon pour les grosses protéines humaines (+ précis vs humains)
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11
Q

limites expression de protéines chez l’insecte?

A
  • pas rapide et moins de protéine -> masse faible chez insecte
  • production baclovirus et infection
  • milieux spéciaux (+ chers)
  • production protéines marquées est difficile
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12
Q

avantages expression dans cellules humaines?

A
  • ponts disulfures, modifications post-traductionnelles et protéines membranaires
  • protéines contaminantes =/= immunogènes
  • vecteur de production avec His-tag
  • codons parfaits - meilleur choix pour GROSSES protéines humaines
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13
Q

limites expression dans cellules humaines?

A
  • pas rapide et moins de protéine -> - cell/volume => masse faible
  • besoin fermenter pour grosse production
  • milieux spéciaux (+ chers)
  • production de protéines marquées est impossible
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14
Q

méthodes de choix pour petites protéines ou domaines - bactérie?

A

pas d’expression -> optimisation codons : insectes ou humaines

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15
Q

méthodes de choix pour petites protéines ou domaines avec ponts disulfure - levure?

A

pas d’expression -> optimisation codons : insectes ou humaines

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16
Q

méthodes de choix pour protéines membranaires?

A

insectes ou humaines

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17
Q

méthodes de choix pour grosses protéines humaines?

A

insectes ou humaines

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18
Q

méthodes de choix pour protéines marquées?

A

bactérie (RMN ou X-Ray) ou levure (RMN)

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19
Q

méthodes de choix pour applications thérapeutiques?

A

humaines

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20
Q

1ère étape de purification pour protéines solubles?

A

capturation : isoler et concentrer

  • précipitation saline
  • chromatographie d’affinité
  • chromatographie par échange d’ions
21
Q

2e étape de purification pour protéines solubles?

A

purification : retirer grosses impuretés

  • chromatographie d’affinité
  • chromatographie par échange d’ions
22
Q

3e étape de purification pour protéines solubles?

A

polir: retirer petites impuretés (comme protéases)
- chromatographie par filtration sur gel
- chromatographie en phase inverse

23
Q

chromatographie en Urée pour corps d’inclusion?

A
  1. chromatographie par échange d’ions (DIFFÉRENCE ENTRE URÉE ET GUANI.)
  2. chromatographie d’affinité His-tag
  3. chromatographie par filtration sur gel
24
Q

chromatographie en Guanidinium pour corps d’inclusion?

A
  1. chromatographie d’affinité His-tag

2. chromatographie par filtration sur gel

25
intervalle de pH pour tampons pour purification
6 < pH < 9 pcq stabilité
26
conséquence augmentation de sels (sulfate d'ammonium) dans la précipitation saline de protéines?
diminution de solubilité pcq en augmentant le sels -> on augmente la liaison hydrophobe-hydrophobe
27
méthodes chromatographie des protéines communes?
1. chromatographie d'affinité 2. chromatographie par échange d'ions 3. chromatographie par filtration sur gel 4. chromatographie en phase inverse
28
types de chromatographie?
- FPLC : pression moyenne | - HPLC : pression haute
29
nombre de tampon pour élution linéaire?
1 | - séparation - efficace même si protocole facile
30
nombre de tampon pour élution par gradient?
2 ou plus | - séparation + efficace même si protocole compliqué
31
caractéristiques détection du signal aux ultraviolets (UV)?
- loi Beer-Lambert : absorbance proportionnelle à concentration
32
filtres UV les plus importants pour des protéines?
- 214 ou 228 nm: + sensible -> détecte groupes amides des aa - 254 nm : - sensible -> détecte seulement le noyau aromatique Phe, Tyr et Trp - 280 nm : détecte seulement noyau aromatique de Tyr et Trp (absorption + forte)
33
caractéristiques de chromatographie d'affinité?
- liaison spécifique entre protéine et résine qui est facilement réversible - propriété biochimique unique de la protéine d'intérêt - BONNE méthode pour 2 premières étapes purification
34
exemples chromatographie d'affinité?
1. protéines natives avec propriété biochimique unique pour ligand 2. protéines de fusion formant liaison avec ligand
35
ligand de la protéine de fusion Glutathion-S-transférase (GST)?
glutathion
36
ligand de la protéine de fusion attache-(His)_6?
Nickel (Ni^2+)
37
type de liaison résine avec ligand d'affinité?
liaison covalente (stable)
38
fonction bras espaceur pour résine d'affinité?
minimiser la liaison avec la matrice et les protéines
39
1ère étape chromatographie d'affinité?
étape d'équilibration
40
2e étape chromatographie d'affinité?
étape de liaison
41
3e étape chromatographie d'affinité?
étape d'élution
42
avantages fusion de GST (chromatographie d'affinité)
- augmente solubilité de la protéine - purification facile avec résine glutathion - élution facile avec petit ligand (glutathion) -> stable et pas cher
43
désavantages fusion de GST (chromatographie d'affinité)
- grosse étiquette/tag - purification =/= possible avec dénaturants -> GST = protéine avec SLM conformation native (pas liaison entre glutathion et notre protéine) - GST forme un dimère -> pas bons pour essais biologiques -> doit enlever tag-GST avec protéases
44
V/F: il est possible de cliver la protéine de fusion après la purification
VRAI -> site de coupure normalement inclus dans le vecteur sélectionné Donc, vérifier qu'il n'y a pas de site de coupure pour la protéase de notre choix dans protéine
45
3 protéases les plus populaires?
1. thrombine 2. facteur Xa 3. TEV (Tobacco Etch Virus - protéase de mosaïque du tabac)
46
avantages fusion poly-histidine
- purification facile avec résine de nickel - élution facile avec petit ligand (imidazole) - purification possible avec détergents et dénaturants - petite étiquette/tag (6 aa)
47
désavantages fusion poly-histidine
- augmente formation de corps d'inclusion - purification =/= possible avec antioxydants comme DTT - pas bon pour purification protéines liant métaux de transition
48
propriétés essentielles pour le compétiteur?
- liaison spécifique, mais aussi liaison facilement réversible (avec résine ou tag) - stable chimiquement et interne (pas réactif) - pas trop cher - petite taille moléculaire : séparation par dialyse après purification

BCM2501 - Macromolécules (4 decks)

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