שיעור 2 - שיטות אימוניות

Question 1

Immunoblot of western blot

Answer 1

שיטה המאפשרת זיהוי של חלבון מסוים מתוך תערובת חלבונים, ולכמת אותו באופן סמי קונסטיטוטיבי יחסי בין דוגמאות שונות.
שלבי השיטה:
1. עושים SDS PAGE כלומר מריצים רגיל בגל כמו שאנחנו מכירים תוך שימוש בחומר מחזר וSDS אך לא צובעים את הדגימות.
2. אלקטרוטרנספר - מצמידים לגל דף מיוחד המורכב בעיקר מניטרוצלולוז המסוגל לקשור אליו חלבונים. ואז מצמידים אלקטרודות בניצב לגל כל שההרצה תתרחש בניצב. הדגימות השליליות יעברו למשטח המצומד שכן הן זזות לכיוון האנודה
3. מוסיפים נוגדן ספציפי המזהה חלבון יחיד בהרצה
4. שמים נוגדן שניוני הקשור קוולנטית לאנזים . הנוגדן השניוני מזהה נוגדן ראשוני. אחר כל שמים סובסטרט שנתפרק לצבע על ידי האנזים.

האנזים הכי מוכר לשימוש הוא HPR המחמצן חומר חסר צבע בשם TNB
לא קושרים את האנזים ישר לנוגדן הראשוני כדי לעשות הגברה של הצבע, לכל נוגדן ראשוני נקשרים מספר נוגדנים שניוניים ועל כן יותר צבע מתקבל מפירוק אנזים

Question 2

השקעה אימונית - immunoprecipitation

Answer 2

שיטה שמטרתה לבודד את החלבון ולנתח אותו
1. מוסיפים נוגדן לתערובת החלבונים לזיהוי החלבון הרצוי
2. מוסיפים חלבון הקשור לכדור אגרוז ומתחבר לנוגדן . נוצר קומפלקס גדול וכבד של נוגדן + אנטיגן (החלבון שלנו) + חלבון מחובר לאגרוז
3. מסרכזים כך שהקומפלקס שוקע
4. לוקחים את המשקע שקיבלנו ומוסיפים SDS עם חומר מחזר ומריצים בגל אלקטרופורזה . מקבלים שלושה בנדים , האמצעי זה החלבון שלנו (בנדים ראשון ואחרון אלה שרשראות הנוגדן). האגרוז כבד מדי מכדי לרוץ בג׳ל

Question 3

immunohistochemical

Answer 3

שיטה המאפשרת זיהוי חלבון רצוי בתוך תאים. דומה ל- western blot אבל כאן אין גל אלקטרופורזה אלא פשוט זורעים נוגדנים ראשוניים על גבי רקמה . ואז נוגדן שניוני שמחובר לאנזים

Question 4

Immunofluorescence

Answer 4

דומה לשיטה immunohistochemical רק שבמקום של נוגדן השני מחובר אנזים, במקרה הזה מחובר חומר פלורסנטי והזיהוי מתבצע בעזרת מיקרוסקופ פלורסנטי

Question 5

GFP

Answer 5

חלבון פלורסנטי המיוצר טבעית על ידי אורגניזמים מסוימים כמו מדוזה למשל
Green fluorescent protein
הצמדת הגן לחלבון זה ליד החלבון הנבדק תוביל ליצירת cDNA וביטוי של חלבון שמהווה את החיבור שלהם ומכונה Fusion protein.
בכל אזור בתא בו יתקבל הביטוי, נדע כי מדובר בחלבון הנבדק
השיטה אינה מצריכה שימוש בנוגדנים. מדובר על שיטה יעילה אך לעיתים עלולה לשנות את תכונות החלבון הנבדק .

Question 6

היכן אורך הגל ארוך יותר , בפליטה או בקליטה

Answer 6

אורך הגל ארוך יותר בפליטה, שכן בקליטה נאבדת אנרגיה ולכן הגל יצא בפחות אנרגיה (אורך גל ארוך יותר)

Question 7

מיון תאים על ידי איקטוב פלורסנטי FACS
Florescence activated cell sorting

Answer 7

שיטה שמטרתה להפריד בין תאים עם רמות ביטוי שונות של חלבון מסוים
קודם מסמנים תאים על ידי סימון פלורסנטי (אימיונופלורסנציה או GFP) .
הדגימה שבה סומנו החלבונים מוכנסת לתוך מכשיר בו כל תא נתקל בלייזר המקפיץ אנרגטית את התאים וגורם לשחרור של אור פלורסנטי.
מצידו של הלייזר יש חיישן המודד את עצמת הפלורסנציה המוקרנת
כאשר המכשיר מזהה פלורסנציה הוא מוסיף מטען שלילי, ואם לא , מוסיף מטען חיובי.
בהמשך , התאים עוברים דרך שדה חשמלי שמפריד בין תאים פלורסנטיים שליליים ללא פלורסנטיים חיוביים
השליליים מייצגים את התאים המכילים את הביטוי החלבוני.

Question 8

Immunogold electron microscopy

Answer 8

לחלבון שנבדק נקשר נוגדן ראשוני ואז שניוני, לשניוני מחובר חלקיק זהב.
לאחר הקשירה של הנוגדנים מבצעים בדיקה במיקרוסקופ אלקטרונים שיורה אלקטרונים . איפה שיש זהב האלקטרונים נבלעים ורואים נקודה כהה.
מאחר והמיקרוסקופ יודע לזהות עד לרמת האטומים, ברזולוציות גבוהות ניתן לעשות הבחנה לגבי המיקום של החלבונים בתא .