Ενότητα 2: Επίδραση περιβαλλοντικών παραγόντων στην ανάπτυξη μικροοργανισμών.

Question 1

Πώς διακρίνονται οι μικροοργανισμοί βάσει της βέλτιστης θερμοκρασίας ανάπτυξής τους;

Answer 1

Βάσει της βέλτιστης θερμοκρασίας ανάπτυξής τους, οι μικροοργανισμοί διακρίνονται σε ψυχρόφιλους, μεσόφιλους, θερμόφιλους και υπερθερμόφιλους.

(Στις παραπάνω κατηγορίες η κατάληξη –φίλος σχετίζεται με το θερμοκρασιακό άριστο ανάπτυξης αυτών.)

Question 2

Ποιοι μικροοργανισμοί ορίζονται ως ψυχρόφιλοι;

Answer 2

Ως ψυχρόφιλοι ορίζονται μικροοργανισμοί που η βέλτιστη θερμοκρασία ανάπτυξής τους είναι μικρότερη των 20οC.

Question 3

Ποιοι μικροοργανισμοί ορίζονται ως μεσόφιλοι;

Answer 3

Μεσόφιλοι ορίζονται εκείνοι που η βέλτιστη θερμοκρασία ανάπτυξής τους είναι μεταξύ 20-45οC

Question 4

Ποιοι μικροοργανισμοί ορίζονται ως θερμόφιλοι;

Answer 4

Θερμόφιλοι ορίζονται εκείνοι που η βέλτιστη θερμοκρασία ανάπτυξής τους
είναι μεταξύ 45-80οC.

Question 5

Ποιοι μικροοργανισμοί ορίζονται ως υπερθερμόφιλοι; Και από τι αποτελούνται;

Answer 5

Υπερθερμόφιλοι ορίζονται εκείνοι που η βέλτιστη θερμοκρασία ανάπτυξής τους είναι μεγαλύτερη των 80οC.

Αποτελούνται σχεδόν αποκλειστικά από Αρχαία.

Question 6

Τι είναι οι ψυχότροφοι και θερμοανθεκτικοί μικροοργανισμοί; και ποιο το θερμοκρασιακό τους εύρος;

Answer 6

Οι ψυχρότροφοι (ή ψυχροανθεκτικοί) και θερμοανθεκτικοί είναι μεσόφιλοι μικροοργανισμοί που το θερμοκρασιακό τους
ελάχιστο και μέγιστο αντίστοιχα βρίσκεται σε θερμοκρασίες μικρότερες των 5-7οC και υψηλότερες των 40-45οC.

Question 7

Τι θρεπτικό υπόστρωμα χρησιμοποιείται για την απαρίθμηση ψυχρότροφων και θερμόφιλων μικροοργανισμών;

Σε τι θερμοκρασίες γίνεται η επώαση και για πόσο χρονικό διάστημα;

Answer 7

Για την απαρίθμηση ψυχρότροφων μικροοργανισμών χρησιμοποιείται ένα γενικής συστάσεως θρεπτικό υπόστρωμα, π.χ. PCA, και επώαση σε χαμηλές θερμοκρασίες (4-5οC) για αρκετό χρονικό διάστημα (πλέον των 2 εβδομάδων).

Για την απαρίθμηση θερμόφιλων μικροοργανισμών χρησιμοποιείται επίσης ένα γενικής συστάσεως θρεπτικό υπόστρωμα, π.χ. PCA, και επώαση στους 55οC για χρονικό διάστημα 3 ημερών, όπου τα τρυβλία τοποθετούνται σε πλαστικές σακούλες με διαβρεγμένο διηθητικό χαρτί, προς διατήρηση της υγρασίας του θρεπτικού μέσου.

Question 8

Πειραματική διαδικασία.

Θα πραγματοποιηθεί χαρακτηρισμός του θερμοκρασιακού εύρους ανάπτυξης γνωστού στελέχους βακτηρίου, καθώς και της βέλτιστης θερμοκρασίας για ανάπτυξη. Η πορεία περιλαμβάνει τα εξής στάδια (4):

Answer 8

1) Παρασκευή 500 ml θρεπτικού υποστρώματος PCA.

Η σύσταση του PCA (pH 7) είναι η ακόλουθη:
0.5% w/v πεπτόνη
0.25% w/v εκχύλισμα ζύμης
0.1% w/v γλυκόζης
1.7% w/v άγαρ
Το παρασκευασμένο υλικό αποστειρώνεται και μεταφέρεται σε τρυβλία Petri.

2) Εμβολιασμός του θρεπτικού υλικού PCA των τρυβλίων με γνωστό στέλεχος βακτηρίου, με χρήση της μεθόδου των παραλλήλων γραμμών.
3) Τοποθέτηση των τρυβλίων σε διαφορετικούς επωαστικούς θαλάμους, ρυθμιζόμενους στις εξής θερμοκρασίες: 5, 10, 15, 20, 30, 37, 40 και 45οC.
4) Παρατήρηση της ανάπτυξης καθημερινώς, καταγραφή του θερμοκρασιακού εύρους ανάπτυξης, καθώς και της βέλτιστης θερμοκρασίας ανάπτυξης (βάσει του χρόνου εμφάνισης της βιομάζας).

Question 9

Επίδραση του pH.

Βάσει της pH ανάπτυξής τους, πώς διακρίνονται οι μικροοργανισμοί;

Answer 9

Βάσει της pH ανάπτυξής τους, οι μικροοργανισμοί διακρίνονται σε οξεόφιλους, ουδετερόφιλους και βασεόφιλους.

Στις παραπάνω κατηγορίες η κατάληξη –φίλος σχετίζεται με το βέλτιστο pH ανάπτυξής τους.

Question 10

Ποιοι μικροοργανισμοί ονομάζονται οξεόφιλοι;

Answer 10

Οξεόφιλοι ονομάζονται οι μικροοργανισμοί που το βέλτιστο pH για ανάπτυξή είναι μικρότερο του pH 5.

Question 11

Ποιοι μικροοργανισμοί ονομάζονται ουδετερόφιλοι;

Answer 11

Ουδετερόφιλοι ονομάζονται εκείνοι που το βέλτιστο pH για ανάπτυξη είναι μεταξύ pH 5 έως 9.

Question 12

Ποιοι μικροοργανισμοί είναι βασεόφιλοι;

Answer 12

Βασεόφιλοι είναι εκείνοι που το βέλτιστο pH για ανάπτυξη είναι μεγαλύτερο του pH 9.

Question 13

Τι μικροοργασνισμοί είναι οι βασεοανθεκτικοί και οι οξεοανθεκτικοί και ποιό το μέγιστο και ελάχιστο pH για ανάπτυξη;

Answer 13

Βασεοανθεκτικοί και οξεοανθεκτικοί είναι ουδετερόφιλοι μικροοργανισμοί που το μέγιστο και ελάχιστο pH για ανάπτυξη είναι πάνω από pH 9 και κάτω από pH 5-5.5 αντίστοιχα.

Question 14

Πειραματική διαδικασία

Θα πραγματοποιηθεί χαρακτηρισμός του εύρους pH για ανάπτυξη γνωστού στελέχους βακτηρίου, καθώς και υπολογισμός του βέλτιστου pH για ανάπτυξη. Η πορεία περιλαμβάνει τα εξής στάδια:

Answer 14

1) Παρασκευή των παρακάτω θρεπτικών υποστρωμάτων (100 ml έκαστο, σε κωνική φιάλη των 250 ml) που όλα αποτελούνται από 1% w/v γλυκόζης, 0.5% w/v εκχύλισμα ζύμης, 5% w/v πεπτόνης, και 0.1 mM MgSO4 καθώς και:

Α) 0.06 M κιτρικού οξέος-0.04 M κιτρικού νατρίου, για την παρασκευή θρεπτικού υποστρώματος pH 4.
Β) 0.035 M κιτρικού οξέος -0.065 M κιτρικού νατρίου, για την παρασκευή θρεπτικού υποστρώματος pH 5.
Γ) 0.013 M Na2HPO4-0.087 M KH2PO4, για την παρασκευή θρεπτικού υποστρώματος pH 6.
Δ) 0.061 M Na2HPO4-0.039 M NaH2PO4, για την παρασκευή θρεπτικού υποστρώματος pH 7.
Ε) 0.095 M Na2HPO4-0.005 M KH2PO4, για την παρασκευή θρεπτικού υποστρώματος pH 8.
ΣΤ) 0.1 M NaHCO3-1 mM K2HPO4, για την παρασκευή θρεπτικού υποστρώματος pH 9.
Ζ) 0.075 M Na2CO3-0.025 M NaHCO3-1 mM K2HPO4, για την παρασκευή θρεπτικού υποστρώματος pH 10.2.
Όλα τα θρεπτικά υποστρώματα αποστειρώνονται.

2) Εμβολιασμός των διαφορετικών θρεπτικών υποστρωμάτων με γνωστό στέλεχος βακτηρίου.
3) Τοποθέτηση των εμβολιασμένων καλλιεργειών σε περιστρεφόμενο επωαστικό θάλαμο στους 30οC.
4) Παρατήρηση της ανάπτυξης καθημερινώς, καταγραφή του εύρους pH για την ανάπτυξη του στελέχους (θολότητα καλλιέργειας), καθώς και του βέλτιστου pH για ανάπτυξη (με μέτρηση της απορρόφησης στα 600 nm).

Question 15

Επίδραση της αλατότητας.

Πώς εκφράζεται το διαθέσιμο στους μικροοργανισμούς νερό;

Answer 15

Το διαθέσιμο στους μικροοργανισμούς νερό εκφράζεται με την ενεργότητα του ύδατος aw που θεωρητικά λαμβάνει τιμές μεταξύ 0 και 1.

Η πλειονότητα των μικροοργανισμών αναπτύσσεται σε aw μεταξύ 0.99 και 0.91,

Για περιβάλλοντα με aw<0.91 (περιβάλλοντα υψηλής αλατότητας και υψηλής συγκέντρωσης σακχάρων δεσμεύουν μόρια νερού) παρατηρείται ανάπτυξη οσμώφιλων μικροοργανισμών, όπως αλόφιλων βακτηρίων και αρχαίων, καθώς και σακχαρόφιλων ζυμών.

Για aw<0.60 δεν παρατηρείται ζωή.

Question 16

Βάσει της ανάπτυξης σε περιβάλλοντα διαφορετικής αλατότητας, οι μικροοργανισμοί διακρίνονται σε αλοανθεκτικούς και αλόφιλους. Πώς αναπτύσσονται;

Answer 16

Οι αλοανθεκτικοί αναπτύσσονται καλύτερα απουσία άλατος, αλλά ανάπτυξη παρατηρείται και σε συγκεντρώσεις άλατος έως 20% w/v.

Οι αλόφιλοι απαιτούν άλας για την ανάπτυξη τους, και διακρίνονται σε ηπίως, μετρίως και εξαιρετικά αλόφιλους, ανάλογα με το αν η βέλτιστη συγκέντρωση NaCl για ανάπτυξη είναι μεταξύ 1-6%, 6-15% και 15-30% w/v αντίστοιχα.

Question 17

Πειραματική διαδικασία
Θα πραγματοποιηθεί προσδιορισμός του εύρους της συγκέντρωσης NaCl, καθώς και της βέλτιστης συγκέντρωσης σε NaCl για την ανάπτυξη γνωστού στελέχους βακτηρίου. Η πορεία περιλαμβάνει τα εξής στάδια:

Answer 17

1) Παρασκευή των παρακάτω θρεπτικών υποστρωμάτων (100 ml έκαστο, σε κωνική φιάλη των 250 ml) που περιέχουν 2.5% w/v πεπτόνης, 0. 5% w/v εκχύλισμα ζύμης και 1.7% w/v άγαρ, καθώς και:

Α) 0% w/v NaCl (χωρίς αλάτι), για την παρασκευή θρεπτικού υποστρώματος
αλατότητας 0%
B) 3% w/v NaCl, για την παρασκευή θρεπτικού υποστρώματος αλατότητας 3%
Γ) 5% w/v NaCl, για την παρασκευή θρεπτικού υποστρώματος αλατότητας 5%
Δ) 10% w/v NaCl, για την παρασκευή θρεπτικού υποστρώματος αλατότητας 10%
Ε) 15% w/v NaCl, για την παρασκευή θρεπτικού υποστρώματος αλατότητας 15%
ΣΤ) 20% w/v NaCl, για την παρασκευή θρεπτικού υποστρώματος αλατότητας 20%
Όλα τα θρεπτικά υποστρώματα αποστειρώνονται και μεταφέρονται σε τρυβλία Petri.

2) Ακολουθεί εμβολιασμός των παραπάνω θρεπτικών υποστρωμάτων με γνωστό στέλεχος βακτηρίου, με χρήση της μεθόδου των παραλλήλων γραμμών.
3) Τοποθέτηση των τρυβλίων (εμβολιασμένων καλλιεργειών) σε επωαστικό θάλαμο στους 30οC.
4) Παρατήρηση της ανάπτυξης καθημερινώς, καταγραφή του εύρους της αλατότητας για ανάπτυξη, καθώς και της βέλτιστης συγκέντρωσης NaCl για ανάπτυξη (βάσει του χρόνου εμφάνισης της βιομάζας).

Question 18

Επίδραση της συγκέντρωσης οξυγόνου

Πώς διακρίνονται οι μικροοργανισμοί βάσει των απαιτήσεών τους σε οξυγόνο;

Answer 18

Οι μικροοργανισμοί, βάσει των απαιτήσεών τους σε οξυγόνο, διακρίνονται σε υποχρεωτικά αερόβιους, μικροαερόφιλους, δυνητικά (προαιρετικά) αναερόβιους, και υποχρεωτικά αναερόβιους.

Question 19

Τι ρόλο παίζει το οξυγόνο στους υποχρεωτικά αερόβιους και αναερόβιους, μικροαερόφιλους και δυνητικά αναερόβιους μικροοργανισμούς;

Answer 19

➤ Οι υποχρεωτικά αερόβιοι απαιτούν οξυγόνο για την επιβίωση και ανάπτυξή τους

➤ Το οξυγόνο είναι δηλητήριο για τους υποχρεωτικά αναερόβιους μικροοργανισμούς

➤ Οι μικροαερόφιλοι ζουν κάτω από χαμηλές συγκεντρώσεις οξυγόνου

➤ Οι δυνητικά αναερόβιοι αναπτύσσονται τόσο παρουσία όσο και απουσία οξυγόνου

Question 20

Ποιοι μικροοργανισμοί χαρακτηρίζονται ως αεροανθεκτικοί;

Answer 20

Ως αεροανθεκτικοί χαρακτηρίζονται οι αναερόβιοι μικροοργανισμοί που επιβιώνουν παρουσία οξυγόνου, χωρίς να το χρησιμοποιούν ως τελικό ηλεκτρονιακό δέκτη.

Question 21

Από τι αποτελούνται τα συστήματα που χρησιμοποιούνται για την κατηγοριοποίηση των μικροοργανισμών βάσει των απαιτήσεών τους σε οξυγόνο;

Answer 21

Για την κατηγοριοποίηση των μικροοργανισμών βάσει των απαιτήσεών τους σε οξυγόνο, χρησιμοποιούνται συστήματα για αναερόβιους μικροοργανισμούς που αποτελούνται από ένα δοχείο που κλείνει ερμητικά (anaerobic jar) και δεν επιτρέπει την είσοδο οξυγόνου, και κασετίνες με υλικά πληρώσεως (γνωστές ως GasPack) που κατακρατούν το οξυγόνο σε σύντομο χρονικό διάστημα.

Question 22

Τι γίνεται με τον υπό εξέταση μικροοργανισμό; (πώς δημιουργούνται αναερόβιες συνθήκες;)

Answer 22

Ο υπό εξέταση μικροοργανισμός εμβολιάζεται σε κατάλληλο θρεπτικό υπόστρωμα, και μαζί με την κασετίνα με το υλικό πληρώσεως (Gas Pack) που διαβρέχεται, τοποθετούνται στο ειδικό δοχείο (anaerobic jar) όπου και σφραγίζονται.

Μέσα στο πρώτο ημίωρο δεσμεύεται το οξυγόνο, και εκλύεται CO2 και Η2, με αποτέλεσμα να δημιουργούνται αναερόβιες συνθήκες.

Question 23

Από τι αποτελείται το υλικό πληρώσεως; και πού χρησιμοποιούνται τέτοια συστήματα;

Answer 23

Το υλικό πληρώσεως αποτελείται από NaBH4, NaΗCO3 και άλας του κιτρικού οξέος.

Τέτοια συστήματα χρησιμοποιούνται και για την ανάπτυξη μικροαερόφιλων μικροοργανισμών, όπου το χρησιμοποιούμενο υλικό πληρώσεως (ίδιας συστάσεως αλλά διαφορετικής αναλογίας) οδηγεί σε ατμόσφαιρα που περιέχει 5-15% οξυγόνο και 5-12% CO2.

Question 24

Πειραματική διαδικασία

Θα πραγματοποιηθεί προσδιορισμός των απαιτήσεων στελέχους βακτηρίου σε οξυγόνο. Η πορεία περιλαμβάνει τα εξής στάδια:

Answer 24

1) Παρασκευή 500 ml θρεπτικού υποστρώματος PCA. Η σύσταση του PCA (pH 7) είναι η ακόλουθη:

0.5% w/v πεπτόνη
0.25% w/v εκχύλισμα ζύμης
0.1% w/v γλυκόζη
1.7% w/v άγαρ
Το παρασκευασμένο υλικό αποστειρώνεται και μεταφέρεται σε τρυβλία Petri.

2) Εμβολιασμός του θρεπτικού υλικού με στέλεχος βακτηρίου, καθώς και με στέλεχος υποχρεωτικά αερόβιου βακτηρίου και δυνητικά αναερόβιου (ή καλύτερα υποχρεωτικά αναερόβιου), με χρήση της μεθόδου των παραλλήλων γραμμών.
3) Τοποθέτηση των τρυβλίων στο ειδικό δοχείο (anaerobic jar).
4) Διαβροχή του Gas Pack με 25 ml H2O (η ακριβής ποσότητα αναγράφεται στις οδηγίες του προμηθευτή).
5) Σφράγιση του δοχείου και τοποθέτηση σε επωαστικό θάλαμο στους 30οC. Οι καλλιέργειες επωάζονται για αρκετό διάστημα.
6) Αξιολόγηση αποτελεσμάτων. Η μη ανάπτυξη του υποχρεωτικά αερόβιου μικροοργανισμού πιστοποιεί τη δημιουργία αναερόβιων συνθηκών, ενώ ο δυνητικά αναερόβιος ή ο υποχρεωτικά αναερόβιος μικροοργανισμός χρησιμοποιείται ως θετικός μάρτυρας.