Ενότητα 1: Απαρίθμηση μικροοργανισμών σε περιβαλλοντικά δείγματα

Question 1

Οι μέθοδοι προσδιορισμού του πληθυσμού διακρίνονται σε άμεσους και έμμεσους. Ποιες είναι;

Answer 1

Άμεσοι:
➤ Μικροσκόπηση
➤ Μέθοδος μέτρησης αποικιών.

Έμμεσοι
➤ Προσδιορισμός της αναπνευστικής δραστηριότητας (μέτρηση κατανάλωσης οξυγόνου ή απελευθέρωση CO2 κατά τον μεταβολισμό μικτού πληθυσμού),
➤ Μέτρηση του ATP που συνδέεται με την οξειδωτική φωσφορυλίωση, καθώς και
➤ Προσδιορισμός της ενζυμικής ενεργότητας βιοκαταλυτών που απαντώνται σε μεγάλο πλήθος μικροοργανισμών, ώστε να αντιπροσωπεύουν την πλειονότητα της βιομάζας (π.χ. προσδιορισμός της ενεργότητας διαφόρων κλάσεων εστερασών και γλυκοσιδασών).

Question 2

Που στηρίζονται οι μέθοδοι έμμεσου προσδιορισμού του μικροβιακού πληθυσμού;

Answer 2

Οι μέθοδοι έμμεσου προσδιορισμού του μικροβιακού πληθυσμού στηρίζονται στην αποδοχή ότι όσο μεγαλύτερος μικροβιακός πληθυσμός υπάρχει, τόσο μεγαλύτερη αναπνευστική ή ενζυμική δραστηριότητα μετράται, αν και η παραδοχή αυτή δεν βρίσκει πάντα αποδοχή.

Question 3

Μέθοδος μέτρησης αποικιών.

Πώς πραγματοποιείται εκτίμηση του μικροβιακού πληθυσμού;

Answer 3

Πραγματοποιείται εκτίμηση του μικροβιακού πληθυσμού βάσει της ανάπτυξης μεμονωμένων κυττάρων (ή συσσωματωμάτων αυτών) που προέρχονται από περιβαλλοντικό δείγμα σε στερεό θρεπτικό υπόστρωμα, σχηματίζοντας μετά από επώαση αντίστοιχο αριθμό αποικιών.

Question 4

Πώς εκφράζεται ο μικροβιακός πληθυσμός στην περίπτωση της μεθόδου μέτρησης αποικιών;

Answer 4

Εκφράζεται ως cfu (colony forming units-μονάδες / αριθμός σχηματιζόμενων αποικιών) ανά μονάδα όγκου (ml, 100 ml ή L) ή μάζας (g ή Kg) δείγματος.

Question 5

Η πρακτική της «1/10» αραίωσης-δημιουργία πρώτου αιωρήματος.

Answer 5

Στερεά δείγματα ή δείγματα με μεγάλο ιξώδες υφίστανται ανάμειξη με κατάλληλο διαλύτη, ώστε να προκύψει αιώρημα κυττάρων, που κατόπιν θα επιστρωθεί ή θα ενσωματωθεί σε κατάλληλο στερεό θρεπτικό υπόστρωμα.

Συνήθως προτιμάται ανάμιξη 10 g δείγματος με 90 ml διαλύτη (ή 100 g δείγματος με 900 ml διαλύτη), αλλά μπορεί να αναμειχθούν και 10 g δείγματος με 100 ml διαλύτη (ή 100 g δείγματος με 1000 ml διαλύτη).

Σε εδαφικά δείγματα συνήθως χρησιμοποιείται ανάμιξη 10 g δείγματος με 95 ml διαλύτη (ή 100 g δείγματος με 950 ml διαλύτη).

Ανεξαρτήτως ποια από τις παραπάνω αναμείξεις θα πραγματοποιηθεί, η διαδικασία αυτή είναι γνωστή και ως «1 προς 10» αραίωση (1/10 ή 10-1).

Η ομογενοποίηση του δείγματος με το διαλύτη γίνεται με ειδικά blenders, mixers, shakers, καθώς και ομογενοποιητές τύπου stomacher.

Question 6

Επιλογή διαλύτη προς ομογενοποίηση. Πώς γίνεται;

Answer 6

➤ Ανάλογα με το είδος του δείγματος, χρησιμοποιείται και κατάλληλος διαλύτης.

➤ Ο διαλύτης πρέπει να προσομοιάζει τα φυσικοχημικά χαρακτηριστικά του δείγματος.

➤ Επιπλέον, η επιλογή του διαλύτη εξαρτάται από την ομάδα των μικροοργανισμών που θέλουμε να απαριθμήσουμε.

Question 7

Ποιοι είναι οι πλέον χρησιμοποιούμενοι διαλύτες;

Answer 7

1) φυσιολογικός ορός (0.85% w/v NaCl)
2) Διάλυμα φωσφορικών αλάτων (συνήθως pH 7). Για την παρασκευή του χρησιμοποιείται διάλυμα 0.061 M Na2HPO4-0.039 M NaH2PO4.
3) Διάλυμα πεπτόνης 0.1% w/v.

Question 8

Πότε χρησιμοποιούνται τα διαλύματα αλάτων και γιατί;

Answer 8

Χρησιμοποιούνται συνήθως όταν ο αναλυτής είναι έμπειρος, αφού η παραμονή τραυματισμένων, από τη διαδικασία, κυττάρων
μπορεί να οδηγήσει σε θανάτωση μέρους του πληθυσμού, και υποεκτίμηση του πληθυσμού.

Question 9

Πώς χρησιμοποιείται το αραιό διάλυμα πεπτόνης;

Answer 9

Αραιό διάλυμα πεπτόνης ως πηγή άνθρακα και ενέργειας συντελεί στην ανάκαμψη τραυματισμένων κυττάρων, αν και μεγάλος χρόνος εκτέλεσης της διαδικασίας καταμέτρησης των αποικιών μπορεί να οδηγήσει σε υπερεκτίμηση του πληθυσμού λόγω διπλασιασμού των κυττάρων.

Question 10

Μπορεί να χρησιμοποιηθεί νερό;

Answer 10

Η χρησιμοποίηση νερού πρέπει να αποφεύγεται, γιατί προκαλεί σπαργή των κυττάρων.

(Σπαργή είναι η διόγκωση του κυτταροπλάσματος και κυρίως των χυμοτοπίων ενός φυτικού κυττάρου, η οποία οφείλεται στη διείσδυση νερού στο εσωτερικό τους, όταν το κύτταρο βυθίζεται σε ένα υποτονικό διάλυμα, δηλαδή σε ένα διάλυμα με μικρότερη συγκέντρωση από αυτήν τού κυττάρου ή τού χυμοτοπίου.)

Question 11

Χρησιμοποιούνται πιο υπέρτονα από το δείγμα διαλύματα;

Answer 11

Δεν χρησιμοποιούνται, διότι η χρήση τους συνοδεύεται από φαινόμενα πλασμόλυσης.

(Πλασμόλυση: ωσμωτικό φαινόμενο που προκαλεί απώλεια νερού από τα κύτταρα και επιφέρει την καταστροφή τους)

Question 12

Τι διαλύματα χρησιμοποιούνται για την εκτίμηση αλoανθεκτικών και σακχαροανθεκτικών/σακχαρόφιλων μικροοργανισμών;

Answer 12

Για την εκτίμηση

➤ Αλoανθεκτικών: διαλύματα 15% και 20% w/v σε NaCl

➤ Σακχαροανθεκτικών/σακχαρόφιλων μικροοργανισμών: σακχαρόζη

Question 13

Τι διαλύτες χρησιμοποιούνται για την απαρίθμηση του καλλιεργήσιμου αναερόβιου μικροβιακού φορτίου;

Answer 13

Χρησιμοποιούνται διαλύτες με αναγωγικές ιδιότητες, π.χ. διάλυμα κυστεΐνης ή θειογλυκολικού άλατος.

Question 14

Τι απαιτείται σε περιπτώσεις που το προς ανάλυση δείγμα περιέχει υψηλό μικροβιακό πληθυσμό και τι διαλύτης χρησιμοποιείται;

Answer 14

Απαιτείται αραίωση.

Ο διαλύτης που χρησιμοποιείται είναι ο ίδιος με εκείνο που χρησιμοποιήθηκε για την αρχική ομογενοποίηση - «1/10» αραίωση.

Question 15

Εμβολιασμός αιωρήματος κυττάρων σε στερεό θρεπτικό υλικό.

Τι απαιτείται για δείγματα όπου δεν είναι γνωστό το αρχικό μικροβιακό φορτίο;

Answer 15

Για δείγματα όπου δεν είναι γνωστό το αρχικό μικροβιακό φορτίο, απαιτείται επίστρωση ή ενσωμάτωση κατάλληλης ποσότητας αιωρήματος κυττάρων από την κάθε αραίωση.

Question 16

Α) Επίστρωση κυττάρων σε στερεό θρεπτικό υλικό. Εξήγηση

Answer 16

Για επίστρωση σε τρυβλίο Petri χρησιμοποιείται 0.1-0.5 ml (σπανίως 1 ml) από κάθε αραίωση.

Αρχικά παρασκευάζεται το κατάλληλο στερεό θρεπτικό υπόστρωμα.

➤ Συνήθως προετοιμάζεται κάποιο γενικής συστάσεως θρεπτικό υπόστρωμα όπως τα PCA-Plate Count Agar, NA-Nutrient Agar και TSA-Tryptic Soy Agar για βακτήρια.
➤ Στην περίπτωση των ζυμών χρησιμοποιούνται τα ΜΕΑ-Malt Extract Agar και PDA-Potato Dextrose Agar.
Είναι δυνατόν να χρησιμοποιηθούν και εκλεκτικά υποστρώματα που επιτρέπουν την απαρίθμηση συγκεκριμένων ομάδων μικροοργανισμών.

Από κάθε αραίωση, λαμβάνεται ασηπτικά εμβόλιο 0.1-0.5 ml που τοποθετείται στην επιφάνεια στερεού θρεπτικού υποστρώματος και επιστρώνεται πλησίον της φλόγας σε θάλαμο νηματικής ροής, με τη βοήθεια μίας αποστειρωμένης γυάλινης ράβδου. Η αποστείρωση της ράβδου πραγματοποιείται με εμβάπτιση αυτής σε διάλυμα αιθανόλης 70% v/v και καύση στην οξειδωτική φλόγα του λύχνου. Η επίστρωση πραγματοποιείται με συνεχείς κυκλικές κινήσεις μέχρι πλήρους απορρόφησης του αιωρήματος από το στερεό θρεπτικό μέσο.

Question 17

Β) Ενσωμάτωση κυττάρων σε στερεό θρεπτικό υπόστρωμα.

Answer 17

Παρασκευάζεται το κατάλληλο στερεό θρεπτικό υπόστρωμα. Όπως προηγουμένως, προετοιμάζεται κάποιο γενικής συστάσεως θρεπτικό υπόστρωμα…

Μετά από αποστείρωση, το στερεό θρεπτικό μέσο κρατείται σε υδατόλουτρο στους 45οC (ώστε να είναι σε υγρή κατάσταση).

Από κάθε αραίωση, λαμβάνεται ασηπτικά εμβόλιο 1 ml που μεταφέρεται στο εσωτερικό κενού τρυβλίου Petri.

Ακολουθεί προσθήκη στερεού θρεπτικού υποστρώματος μέχρι πλήρους καλύψεως του εμβολίου με ελαφριά ανακίνηση.

Μετά την πήξη του θρεπτικού υποστρώματος, τα τρυβλία τοποθετούνται σε επωαστικό θάλαμο προς ανάπτυξη των αποικιών.

Αποικίες εμφανίζονται σε όλη την έκταση του θρεπτικού υποστρώματος, ενώ σε περιπτώσεις που επιθυμείται η μελέτη αναερόβιων μικροοργανισμών είναι δυνατή η προσθήκη ενός επιπλέον στρώματος στερεού υποστρώματος μετά την πήξη του πρώτου.

Η θερμοκρασία του υποστρώματος δεν πρέπει να ξεπερνάει τους 45οC, αφού υψηλές θερμοκρασίες μπορούν να προκαλέσουν θανάτωση μέρους της μεσόφιλης μικροχλωρίδας.

Ο τρόπος αυτός εμβολιασμού αντενδείκνυται σε περίπτωση απαρίθμησης του ψυχρότροφου πληθυσμού, αφού μπορεί να
προκαλέσει θερμοκρασιακό σοκ και θανάτωση μεγάλου μέρους της ψυχρότροφης μικροχλωρίδας, καθώς και σε περιπτώσεις εκτίμησης του θερμόφιλου/υπερθερμόφιλου πληθυσμού, όπου η μεν τοποθέτηση των τρυβλίων σε θερμοκρασία δωματίου προκαλεί θερμοκρασιακό σοκ, η δε παραμονή του θρεπτικού υποστρώματος σε θερμοκρασίες μεγαλύτερες των 45οC δεν επιτρέπει την πήξη του.

Question 18

Σε τι θερμοκρασίες πραγματοποιείται επώαση για τη μεσόφιλη μικροχλωρίδα;

Answer 18

Για τη μεσόφιλη μικροχλωρίδα πραγματοποιείται επώαση σε θερμοκρασίες μεταξύ 30-37οC, ενώ, στην περίπτωση που χρησιμοποιείται ένα γενικής συστάσεως θρεπτικό υπόστρωμα και επώαση σε μεσόφιλες συνθήκες, έχουμε εκτίμηση της
ολικής μεσόφιλης χλωρίδας (Ο.Μ.Χ).

Συνήθως για την μικροβιολογική εκτίμηση της ποιότητας του νερού επιλέγεται η καταμέτρηση του μικροβιακού πληθυσμού στους 22 και 37οC.

Question 19

Πλεονεκτήματα και μειονεκτήματα μεθόδου μέτρησης αποικιών

Answer 19

Τα μειονεκτήματα της μεθόδου είναι:

Α) συσσωματώματα κυττάρων οδηγούν σε υποεκτίμηση του πληθυσμού

Β) πολλά κύτταρα θανατώνονται κατά την διαδικασία

Γ) τα θρεπτικά υποστρώματα, αν και γενικής συστάσεως, δεν ικανοποιούν τις απαιτήσεις όλων των καλλιεργήσιμων μικροοργανισμών

Δ) δεν επιτρέπει η μέθοδος τον ικανοποιητικό προσδιορισμό του πληθυσμού πολυκύτταρων μικροοργανισμών, όπως π.χ.
μυκήτων, αφού κονίδια αυτών, αρθροσπόρια και τμήματα υφών μπορούν να οδηγήσουν σε υπερεκτίμηση του πληθυσμού

Ε) το γεγονός ότι οι μικροοργανισμοί έχουν διαφορετικά όρια θερμοκρασίας, pH, αλατότητας κλπ για ανάπτυξη καθώς και διαφορετικές απαιτήσεις σε οξυγόνο

ΣΤ) οι μικροοργανισμοί που καλλιεργούνται αποτελούν κατά εκτίμηση μόνο το 1% του συνολικού πληθυσμού αυτών

Το μεγαλύτερο πλεονέκτημα της μεθόδου είναι ότι επιτρέπει την απομόνωση καθαρών στελεχών μικροοργανισμών.

Question 20

Πειραματική διαδικασία.

Θα εξεταστεί δείγμα πόσιμου νερού ή υγρά απόβλητα ελαιουργείου, και αναλυτικά η διαδικασία περιλαμβάνει τα εξής στάδια:

Answer 20

1) Παρασκευή 500 ml θρεπτικού υλικού PCA (Plate Count Agar).

Η σύσταση του PCA (pH 7) είναι η ακόλουθη:
0.5% w/v πεπτόνη
0.25% w/v εκχύλισμα ζύμης
0.1% w/v γλυκόζης
1.7% w/v άγαρ
Μετά από αποστείρωση ακολουθεί προσθήκη του υλικού σε τρυβλία Petri.

2) Παρασκευή 200 ml διαλύματος 0.1% w/v πεπτόνης. Σε κωνική φιάλη θα τοποθετηθούν 90 ml, ενώ η υπόλοιπη ποσότητα θα διοχετευθεί σε δοκιμαστικούς σωλήνες (9 ml σε κάθε σωλήνα).
3) Αποστείρωση ακρορύγχιων μικροπιπετών.
4) Ανάμιξη 10 ml δείγματος σε 90 ml διαλύματος 0.1% w/v πεπτόνης (“1/10” αραίωση)
5) Πραγματοποίηση διαδοχικών δεκαδικών αραιώσεων (1 ml σε 9 ml αραιού διαλύματος πεπτόνης) έως την 10-7 αραίωση.
6) Εμβολιασμός με επίστρωση 0.2 ml από κάθε αραίωση σε θρεπτικό υλικό PCA
7) Επώαση στους 37οC.
8) Μέτρηση αποικιών μετά από 24 ώρες, και υπολογισμοί.