- הרצאה 2ביטוי חלבונים חיצוניים בחיידקים ע"י שימוש בפלסמידים ווירוסים Flashcards
הרצאה 2
מה הרעיון המרכזי בשיטה
הרעיון הוא להשתמש בהנדסה גנטית כדי לייצר גנים ע” י שימוש בבקטריות )וירוס של
חיידקים( ולבטא את החלבונים שאנחנו רוצים.
החדרת סי דנא לפלסמיד של אי קולי בעל אופרון הלקטוז- מה המטרה
בקרת שעתוק של גן רצוי
איך נראה שעתוק של הגן שהחדרנו עם הCDNA
IPTG נכנס ומשמש כאינדיוסר לרפרסור ואז הגנים משועתקים
איך נבדיל בין נהפלסמידים שמכילים את המחדר לכאלה שלא
סלקציית כחול לבן
מכניסים את גן לאקזי בטא גלוקטוזידאז
מכניסים למצע XGAL
חיידק שלא הוחדר לו יצבע בכחול כי יפרק את איקס גאל
חיידק עם הפךלסמיד ישאר לבן כי המחדר נכנס לאיזור של בטא גלוקטוזידאז ופגע בפעילוץ שלו
למה משתמשים בכרומטוגרפיית הפרדה על בסיס זיקה?
לעיתים נרצה לשעתק את החלבון שלנו יחד עם חלבונים אחרים שכבר קיימים בתא, ולבודד אותו אחכ
איך נתבצעת הכרומטוגרפיה
מכניסים את החלבון לוקטור עם זנב
מכניסים לקולונה ומוסיפים ליגנד
הליגנד נקשר לזנב ומשאיר אותו בפנים
כל החלבונים האחרים יצאו ועכשיו אפשר להכניס חומר עם זיקה גבוה לליגנד
נוסיף טרומביןשחותך את הזנב מהחלבון ואז החלבון שלנו יצא
באיזה וקטור אפשר להשתמש במערכת של הכרומטוגרפיה
pCAL
מה יש בוקטור PCAL
קטור מכיל:
1 .פרומוטר של אופרון הלקטוז
2 .אתר קישור לקלומודולין ) CBP -( זה בעצם הזנב )חלבון( שייקשר לקלמודולין – שהוא
הליגנד.
3 .אתר קישור לריבוזום
4 .החלבון המהונדס – protein .לאחר התרגום הוא יימצא בציטופלזמה כמו כל החלבונים.
5 .אתר קישור לטרומבין – טרומבין הוא פרוטאזה, שבסוף התהליך יחתוך את
הזנב מהחלבון הנקי שלנו.
מה זה CBP בPCAL
הליגנד
מה זה EGTA בPCAL
מי שמתחרה על הקשר על הליגנד עם החלבון
ה- EGTA נקשרת ליוני הסידן כך שהם
מתנתקים מהקלמודולין, מה שגורם לאתר הפעיל של הקלמודולין ‘להיפתח’ ולשחרר את
החלבון שלנו )עם הזנב(
מה הוא וקטור PET
מערכת זו היא מערכת דומה לקודמת, שבה ע”י שימוש באלמנטים מאופרון הלקטוז נוכל
לשלוט בבקרה של הגנים שאנו מכניסים. המערכת מורכבת מ-2 חלקים:
1 .פלסמיד עם הגן לחלבון הרצוי
2 .וקטור שיבוט המכיל את הגן ל- polymerase RNA T7 ,שנמצא תחת הבקרה של
הפרומוטר של lacI – הרפרסור של האופרון. כלומר, הגן לפולימראז יתבטא רק אם
יוסר הרפרסור, מה שיקרה בנוכחות IPTG .
מה מכיל פלסמיד PET
3720 בסיסים
פרומוטור T7 – פרומוטר חזק שיאפשר ביטוי חזק של הגן
וסינתזה מוגברת של החלבון הרצוי.
- אתר היכרות לריבוזום AGGAGA .
- leader pelB - חלבון חוצה ממברנה המעביר את החלבון אל
החלל הפריפלסמי של התא לאחר התרגום. כיוון שאזור זה הוא
יחסית נקי – אין בו הרבה חלבונים/יונים אחרים אלא בעיקר מים,
זה יעזור לנו לנקות את החלבון.
- אתרי בקרה יחודיים לביטוי הגן המשובט .
- ‘זנב’ של 6 ח”א מסוג היסטידין, בעל זיקה גבוהה לניקל Ni
- טרמינטור - מסיים שעתור T7 .
ORI
מי הליגנד בPET
ניקל
איך נשחרר את החלבון בPET
בעזרת אימידזול
או הורדת PH
האם בPET צריך לחתוך זנב?
לא
אין זנב בכלל
למה נשתמש בוירוסים כוקטורי שיבוט
השימוש בוירוסים כווקטורי שיבוט הוא מאד נפוץ כיוון שאפשר בעזרתם להעביר מידע גנטי בין אורגניזמים, ובנוסף הם משתכפלים בצורה מהירה ונוכל להשתמש במערכת הזו על מנת לבטא כמות גדולה של חלבונים.
WHAT ARE PHAGES
Phages are viruses that infect bacteria
HOW IS THE PHAGE BUILT
- Head: contains one copy of the genome of the phage in a linear form (dsDNA of about 50,000 bp.
- Tail: made of elastic proteins; the structure is a kind of syringe that helps injecting the
phage DNA into the bacteria
3.Spikes or tail fibers: used to attach the phage to the bacteria as a first stage of infection
מה הוא המסלול הליטי?
צורה שבא וירוס נכנס- אם המצע עשיר – נלך למסלול הליטי ושם גם
יש ייצור של פאג’ים חדשים, הוירוס מכפיל את
עצמו ואז יוצר את החלקים האחרים שיהפכו
אותו לבקטריופאג’ – קפסיד, חלבוני מעטפת
וכו’. יש מוות של התא, הוירוסים החדשים
משתחררים ויכולים להתפשט לתאים נוספים.
מה הוא המסלול הליזוגני
אם המצע עני – מסלול ליזוגני. הגנום של הוירוס לא משתכפל אלא עובר אינטגרציה לתוך הגנום של החיידק , תמיד באותו מקום מבחינת ה-DNA של שניהם. זה קורה ע"י רקומבינציה הומולוגית. כשתנאים מתחילים להיות טובים יותר או אם קורה אירוע קיצוני הגנום הוירוסי משתחרר מהגנום ונכנס למסלול הליטי. אם לא קורה כלום – הוירוס יכול להישאר לאורך הרבה דורות בגנום של החיידק.
איזה חלקים יש בגנום של הוירוס
בגנום של הוירוס יש 3 חלקים:
1 .שעות 7-1 בשעון – גנים שמתבטאים במסלול הליטי, אחראים להכפלה ולהכנת גוף הוירוס.
2 .שעות 11-7 :גנים שמתבטאים במסלול הליזוגני – גנים אינטגראליים, גנים שעוזרים
לרקומבינציה בין הגנומים.
ATT -זה אתר הרקומבינציה בין שניהם הגנומים במסלול הליזוגני.
3 .משעה 12 עד 1 אלה גנים שאחראים על הרגולציה – לאיזה מסלול ללכת. אף פעם לא יהיה
ביטוי של הגנים של המסלולים יחד. ברגע שמסלול אחד נבחר – הגנים של המסלול השני
מושתקים.
*אתר cos – תמיד אותו אתר, הוא זה שמאפשר את ההפיכה של הגנום מליניארי למעגלי אחרי
ההזרקה ואורכו 12 נוקליאוטידים. בעצם במפה הליניארית אלה הגנים שנמצאים ב-2 הקצוות
ומתחברים בצורה קומפלימנטרית.
איך נבטיח שהוירוס תמיד ייכנס למסלול
הליטי
את הגנים המקודדים לחלבונים הרצויים נכניס במקום הגנים שדרושים למסלול הליזוגני
מה זה M13
הוירוס נקשר לחיידק אי-קולי שהוא +F ומזריק את ה- DNA החד-גדילי שלו )שצורתו היא
פילמנטית – שרשרת ארוכה( דרך הפילוס שנוצר
הוא רק משתכפל ויוצא מהתא לא הורג
