16. POGLAVJE: CIKEL CITRONSKE KISLINE Flashcards
CIKEL CITRONSKE KISLINE
cikel trikarboksilnih kislin = Krebsov cikel = cikel citronske kisline
v piruvatu je shranjeno še veliko energije, ki jo lahko pridobimo skozi reakcije Krebsovega cikla
CELIČNO DIHANJE
CELIČNO DIHANJE je proces v katerem celice porabljajo O2 in proizvajajo CO2 in vodo
* v tem procesu dobimo več energije (ATP) iz glukoze kot pri glikolizi, ki je le del te poti
* energija dobimo tudi iz maščob in aminokislin
* proces se je razvil v evoluciji, pred približno 2.5 milijarde let (fotosintetski organizmi so začeli proizvajati kisik)
* proces poteka v živalih, rastlinah in mnogih mikroorganizmih
* tri glavne faze celičnega dihanja so:
o proizvodnja acetil-CoA
o oksidacija acetil-CoA
o prenos elektronov v procesu oksidativne fosforilacije (vzpostavi se protonski
gradient)
Na kratko opiši faze celičnega dihanja
prva faza celičnega dihanja
proizvodnja acetil-CoA
* Sinteza nekaj ATP, NADH in FADH2
* Acetil-CoA dobimo iz OH (preko piruvata), lahko tudi z beta oksidacijo maščobnih kislin ali pa iz amino kislin
* Gre za konvergetni katabolizem (acetil- CoA je produkt, h kateremu katabolizem konvergira)
druga faza celičnega dihanja
oksidacija acetil-CoA
* Dobimo še več NADH in
FADH2 in en GTP
* Oksidacija acetil-CoA, ki poteka v Krebsovem ciklu
* 2 C atoma se oksidirata do CO2
* Dobimo še več elektronov, ki vstopijo v tretjo fazo
tretja faza celičnega dihanja
prenos elektronov v procesu oksidativne fosforilacije
* Dobimo veliko ATP
* Prenos elektronov, končni sprejemnik je kisik
* Kisik sprejme elektrone in se reducira v vodo
* Protonski gradient poganja ATP sintazo (nastanek ATP)
Kje poteka cikel citronke kisline?
Pri evkariontih poteka cikel TCA v mitohondrijih
* glikoliza poteka v citoplazmi
* cikel citronske kisline poteka v matriksu mitohondrija (razen sukcinat dehidogenaze, ki je na notranji m. membrani)
* oksidativna fosforilacija poteka na notranji mitohondrijski membrani (zelo nagubana, prisotne kriste/gube – velika površina – veliko proteinov)
- Piruvat se mora transportirati v mitohondrij skozi 2 membrani
o zunanja membrana ima veliko por, kanalčkov, akvaporinov
o notranja membrana pa skoraj ničesar ne prepušča, za prehod skozi membrano
potrebujemo specifične transportne proteine - Priuvat gre skozi zunanjo membrano skozi od napetosti-odvisne anionske kanalčke, za prehod skozi notranjo pa je potrebna prisotnost proteinov MCP1 in MCP2 (mitohondrijski prenašalni protein)
- PRODUKCIJA ACETIL-COA
1.1. Pretvorba piruvata v acetil-CoA
- reakcija: oksidativna dekarboksilacija piruvata
o acetil-CoA lahko vstopi v cikel TCA in se oksidira, da dobimo energijo
o acetil-CoA se lahko porabi za sintezo maščob - potrebnih je pet kofaktorjev
- reakcijo katalizira piruvat dehidrogenazni kompleks
- Reakcija zgleda preprosta, a ni tako zelo preprosta (veliko kofaktorjev je potrebnih za potek)
- Potrebni so trije encimi, ki skupaj tvorijo kompleks
- Piruvat se oksidativno dekarboksilira
o CO2 gre ven
o Iz aldehida nastane tioester (se je oksidiral) - Usoda acetil-CoA je lahko zelo ralična; odvisno koliko energije imamo na voljo
o sinteza maščobnih kislin (shranijo se v adipocitih kot zaloga energije)
o sinteza holesterola
o sinteza skeletov AK
Enosmerna reakcija, termodinamsko zelo ugodna (poteče samo v eni smeri)
- PRODUKCIJA ACETIL-COA
Piruvat dehidrogenzani kompleks (PDC)
- PDC je velik (Mr = 7.8 × 106 Da) multiencimski kompleks sestavljen iz:
-piruvat dehidrogenaze (E1)
-dihidrolipoil transacetilaze (E2)
-dihidrolipoil dehidrogenaze (E3) - kratke razdalje med katalitičnimi mesti omogočajo neposreden prenos substratov iz enega na drugo mesto- usmerjanje substrata
- direkten prenos intermediatov onemogoča stranske reakcije
- aktivnost kompleksa je regulirana
Zakaj so multiencimski kompleksi koristni v celicah?
Omogoča usmerjanje substrata – encimi si podajajo intermediate in s tem onemogočijo stranske reakcije, kjer bi substrati lahko reagirali s čim drugim; gibanje je naključno.
Krio-elektronska mikroskopija PDC
za določanje strukture
- PRODUKCIJA ACETIL-COA
Koencimi in prostetične skupine (kofaktorji)
struktura CoA
struktura lipoil-lizina
- koencimi (niso permanentno del encima): NAD+, CoA-SH
- prostetične skupine: tiamin-pirofosfat (TPP), lipoil-lizin in flavin-adenin nukleotid (FAD)
- viri teh koencimov in prostetičnih skupin:
-vitamin B1 ali tiamin: vir TPP
-vitamin B2 ali riboflavin: vir FAD
-vitamin B3 ali niacin ali nikotinska kislina: vir NAD
-vitamin B5 ali pantotenska kislina: vir CoA
struktura CoA
* koencimi ali kosubstrati niso permanentno del encima; z encimom so povezani, ko pa opravijo funkcijo oddisociirajo
* funkcija CoA je sprejem in prenos acilnih skupin
CoA je sestavljen iz 3 enot:
* ATP
* pantotenske kisline
* betamerkaptoetilamina
Aktivno mesto je tiolna skupina
* lahko tvori tioestre z acilnimi skupinami (npr. acetil CoA – za prenos acilnih skupin)
struktura lipoil-lizina
* prostetične skupine so močno vezane na protein
* lipojska kislina je kovalentno povezana z encimom preko Lys
* Lizin je primarni amin (lahko tvori amidne vezi); velikokrat veže prostetične skupine
* Amidna vez povezuje lipojsko kislino z encimom
* Dihidrolipoil transacetilaza ima lipojsko kislino kot prostetično skupino kovalentno vezano (post translacijska modifikacija)
* Ima dve SH skupini, ki se lahko oksidirata, lahko pa sprejme elektrone in se reducira, lahko tvori tudi tiolne estre
- PRODUKCIJA ACETIL-COA
Potek oksidativne dekarboksilacije piruvata
1) dekarboksilacija piruvata v aldehid
dekarboksilacija piruvata in vezava hidroksietila na tiamin pirofosfat
2)oksidacija aldehida v karboksilno kislino
3)tvorba acetil-CoA
oksidirana oblika lipoillizina sprejme elektrone, ki se sporstijo ob oksidaciji, dobimo kovalenten intermediat
lipoillizin okrog prenaša intermediat (transfer acetata na lipoillizin, dobimo acillipoillizin)
dihidrolipoil transacetilaza (v aktivno mesto vstopi acetil CoA), pride do prenosa acetilne skupine iz acil
lipoillizina na CoA, dobimo acetil CoA)
4)reoksidacija lipoamidnega kofaktorja
tretji encim služi za prenos elektronov iz reducirane oblike lipoillizina, da dobimo obnovljeno obliko oksidiranega lipoillizina
5)regeneracija oksidiranega FAD faktorja
elektroni se iz reducirane oblike lipoillizina prenesejo na FAD (je prostetična skupina, reducira se v FADH2), elektrone odnesejo NAD+, ki so prav tako vezani na dihidrolipoil dehidrogenazo, NADH pa prenese elektrone v elektronsko prenašalno verigo, kjer potujejo do kisika
- CIKEL CITRONSKE KISLINE
naštej stopnje
- Formacija citrata
- Formacija izocitrata z encimom akonitaza
- Oksidativna dekarboksilacija izocitrata do alfa-ketoglutarata
- Oksidacija alfa-ketoglutarata
- Pretvorba sukcinil-CoA v sukcinat
- Oksidacija sukcinata do fumarata
- Pretvorba fumarata v malat z adicijo vode
- Oksidacija malata v oksaloacetat
- Če potrebujemo ATP, gre acetil CoA v cikel citronske kisline
- Acetat vstopi in se kondenzira skupaj z oksaloacetatom, se oksidira v 2 molekuli CO2 (produkta)
- Ostali C atomi so intermediati in niso produkti cikla
- Intermediate lahko porabimo za druge metabolne poti, a jih moramo nadomestiti
- Glavni izkupiček cikla so elektroni, ki se prenesejo po prenašalni verigi, ki prispevajo k protonskemu gradientu, ki omogoča sintezo ATP
- Direktno dobimo tudi GTP (substratna fosforilacija)
krebsov cikel ne more potekati brez O2, ker potrebuje šrenašalce v oksidirani obliki
- CIKEL CITRONSKE KISLINE
- Formacija citrata
mehanizem
- edina reakcija tega cikla, kjer pride do nastanka C-C vezi (Claisnova kondenzacija)
- skoraj popolnoma ireverzibilna reakcija
- V reakcijo vstopata oksaloacetat in acetil-CoA
- Encim, ki katalizira reakcijo je citrat sintaza, dobimo citrat
- Reakcija je termodinamsko zelo ugodna
Citrat sintaza
* sintaze so encimi, ki katalizirajo reakcije kondenzacije, produkti so kompleksnejši od
reaktantov, NE porablja se NTP (ATP, GTP,…)
* sintetaze pa pri sintezi porabljajo energijo v obliki NTP
Inducirano prileganje: Po vezavi oksaloacetata pride do velikih konformacijskih sprememb v encimu.
Dobimo zaprto konformacijo, šele potem se lahko veže acetil-CoA. prva kontrola!!
(oksaloacetat je prekurzor v glukoneogenezi – takrat ne bo potekal Krebsov cikel)
V mitohondrijih je oksaloacetata malo.
Mehanizem reakcije
* Ko imamo vezan oksaloacetat se lahko veže acetil-CoA
* V aktivnem mestu imamo 2 histidina in eno asparaginsko kislino (deluje kot splošna baza, odcepi proton, dobimo enolni intermediat)
* Histidini so protonirani, lahko oddajo protone
* Pride do prenosa elektronskega para na enolni intermediat
* Pride tudi do napada karbonilnega ogljika, ki ima manjko naboja
* Dobimo citroil-CoA
* Pride do hidrolize, odcepi se CoA
* CoA je na voljo za piruvat dehidrogenazni kompleks
* Nastane citrat
* Asp in His so zopet v prvotnem stanju
- CIKEL CITRONSKE KISLINE
2.Formacija izocitrata z encimom akonitaza
- citrat je kot terciarni alkohol slab substrat za oksidacijo
- z eliminacijo H2O iz citrata dobimo cis C=C vez
- adicija H2O na cis-akonitat je stereospecifična
- izocitrat, sekundarni alkohol je dober substrat za oksidacijo
Reakcija eliminacija vode iz citrata in takoj nato adicija vode na cis-akonitat je katalizirana preko Fe-S
- Citrat v akonitazi je vezan na katalitični center, ki ga tvori železosulfidna kletka in je pritrjena s cisteini
- Železo stabilizira vse negativne naboje in omogoči izomerizacijo
- CIKEL CITRONSKE KISLINE
- Oksidativna dekarboksilacija izocitrata do alfa-ketoglutarata
Okisdacija alkohola v keton poteka s prenosom hidridnega iona na nikotinamidni kofaktor.
- Poznamo več različnih izotipov – podobni encimi katalizirajo enako reakcijo (nekateri uporabljajo NAD+ drugi pa NADP+)
- NAD(P)+ se reducira, potem pride do dekarboksilacije
- Mangan stabilizira negativni naboj
- Produkt je za en C manjši
- CIKEL CITRONSKE KISLINE
- Oksidacija alfa-ketoglutarata
- Encim: α-ketoglutarat- dehidrogenazni kompleks
- zelo je podoben kompleksu piruvatne dehidrogenaze
- enaki koencimi, enak mehanizem
nastane sukcinil-Co-A - Podobnost s piruvat dehidrogenaznim kompleksom (vse reakcije so podobne)
- Pride do oksidativne dekarboksilacije
- Produkt je sukcinil-CoA
- Reakcije je termodinamsko ugodna
- CIKEL CITRONSKE KISLINE
- Pretvorba sukcinil-CoA
Pretvorba sukcinil-CoA v sukcinat
* Dobimo GTP, ki se lahko pretvori v ATP
encim: sukcinil-Co-A sintetaza
- Sintetaza = nastopa GTP
- Tvori se sukcinat, energija hidrolize se porabi za substratno fosforilacijo GDPja
- Sukcinil-CoA sintetaza veže sukcinil-CoA, vstopi anorganski fosfat, ki nadomesti S-CoA (dobra izstopajoča skupina)
- Dobimo sukcinil fosfat; v naslednjem koraku se fosforilna skupina kovalentno prenese na encim, dobimo fosforiliran encim
- Encim prenese fosfatno skupino na GDP, tvori se GTP (substratna fosforilacija z indirektnim prenosom; edina substratna fosforilacija v Krebsovem ciklu – velikokrat izpitno vprašanje!!!!)
- Ko so rešili strukturo encima, so ugotovili, da ni prisotnega nobenega Mg ali Lys, ki bi stabilizirala negativni naboj
- So pa ugotovili prisotnost alfa vijačnic, ki imajo dipolni moment
- CIKEL CITRONSKE KISLINE
- Oksidacija sukcinata
Oksidacija sukcinata do fumarata
* kovalentno vezan FAD se reducira v FADH2
* FADH2 poda elektrone koencimu Q
* reduciran koencim Q (QH2) se lahko porabi za sintezo ATP
- Sukcinat se oksidira v fumarat v prisotnosti sukcinat dehidrogenaze
- FAD je prostetična skupina
- Koencim Q je prenašalec elektronov v hidrofobnem okolju (membrane mitohondija), prenese elektrone iz FADH2
- CIKEL CITRONSKE KISLINE
- Pretvorba fumarata
Pretvorba fumarata v malat z adicijo vode
* fumaraza (fumarat hidrataza) je stereospecifična
* najprej se OH- doda fumaratu … nato pa H+ k prej nastalemu karboanionu
* trans adicija vode
* reverzibilna reakcija
- Kjerkoli nastane dvojna vez
pogosto sledi adicija vode - Fumaraza doda OH skupino in nato še proton
- Reakcija je stereospecifična; to omogoča reaktivno mesto encima
- Simetrični substrati se lahko pretvorijo v nesimetrične produkte
- CIKEL CITRONSKE KISLINE
- Oksidacija malata
Oksidacija malata v oksaloacetat
* TD neugodna, oksaloacetata v celici malo, zato poteka
* oksidacija poteče, ker je konc oksaloacetata zelo nizka, kar se kontinuirano porablja za sintezo citrata
- Hidroksilno skupino je potrebno oksidirati do ketona da dobimo oksaloacetat (krog se zaključi)
Karakteristike citratnega cikla
Produkti
Zakaj je cikel tako zakompliciran?
Vloga cikla citronske kisline v anabolizmu
Produkti enega cikla:
* ogljiki acetilnih skupin se oksidirajo do CO2
* ektroni v procesu reducirajo NAD+ in FAD
* tvori se en GTP (=ATP)
* intermediati se obnavljajo
Acetil-Co-A + 3NAD+ + FAD + GDP + P + 2H2O -> 2CO2 + 3NADH + FADH2 + GTP + CoA + 3H+
Oksidirane oblike prenašalcev se morajo ohranjati – potreben je kisik
Zakaj je cikel tako zakompliciran?
* Vsi intermediati cikla največkrat nastopajo tudi kot sintetski prekurzorji za sintezo različnih snovi, ki jih celica potrebuje
* Alfa-ketoglutarat lahko vodi do glutaminske kisline (če ga
transaminiramo), sukcinil-CoA prav tako, če poti združimo, dobilo cikel
trikarboksilnih kislin (ključen za oksidacijo in proizvodnjo
intermediatov)
Vloga cikla citronske kisline v anabolizmu
* Anabolični procesi: potrebujemo prekurzorje za sintezo različnih spojin
* Katabolični procesi: procesi razgradnje
* Če odvajamo intermediate, jih je potrebno nadomeščati
cikel je amfiboličen= uporaben za katabolične in anabolične procese
Anaplerotične reakcije
Anaplerotične reakcije
* reakcije, ki obnavljajo metabolite cikla
* 4-C intermediati se lahko obnovijo s karboksilacijo 3-C prekurzorjev
- Oksaloacetat se obnavlja s fosforilacijo piruvata ali fosfoenolpiruvata
- Malat pa se lahko obnavlja s forforilacijo piruvata
Za vse reakcije skoraj vedno nastopa prostetična skupina biotin=vitamin B7
* Je kovalentno vezan na lizin
* Karboksilna skupina reagira z aminskim delom lizina, dobimo izopeptidno vez s katero je biotin vezan v piruvat karboksilazo (2 katalitični mesti)
* Najprej se karboksilira biotin, drugo mesto pa je transfrazno
* Aktivacija CO2 v vodi – karboksifosfat karboksilira biotin, nato pa pride do prenosa karboksilne skupine na substrat (piruvat -> oksaloacetat, biotin je spet sproščen)
* V jajčnem beljaku je protein avidin, ki veže biotin (verjetno za zaščito pred bakterijami)
* Biotin je v biokemiji zelo uporaben, pomembna tudi afiniteta med biotinom in avidinom
- Lipojska kislina ima prostetično skupino na repku
- Acil prenašalni protein vsebuje serin, ki povezuje prostetično skupino z encimom
Regulacija cikla citronske kisline
Kaj zavira Krebsov cikel?
* ATP (imamo dovolj energije)
* NADH (kaže na to, da imamo dovolj energije;
NAD+ pa kaže na to, da nimamo dovolj energije)
Kaj spodbuja Krebsov cikel?
* AMP
* CoA
* NAD+
* Ca2+ (v miocitih to nakazuje na delovanje, ATP se porablja; imamo kalcij vezavne domene s kalmodulinom, ki so priročni za regulacijo)
Smiselno je regulirati citrat sintazo (ne rabiš se učit za posamezen encim kaj naredi; moraš pa logično sklepat)
Kakšen vpliv ima kalcij na izocitrat dehidrogenazo?
Vemo, da je to encim Krebosvega cikla, Ca2+ se poveča ob delovanju mišic – Ca2+ ima pozitivni regulatorni vpliv na izocitrat dehidrogenazo
GLIOKSILATNI CIKEL
- vretenčarji ne morejo pretvoriti acetata v glukozo, torej ne morejo proizvajati glukoze iz maščob
- rastline, nekateri nevretenčarji in nekateri mikroorganizmi pa s pomočjo encimov glioksilatnega cikla lahko pretvarjajo acetat v ogljikove hidrate
- Glioksilatni cikel poteka v glioksisomih
- Imamo citrat sintazo, nastane akonitaza in nato izocitrat
- Izocitrat liaza ragradi izocitrat na sukcinat (produkt, izstotopi iz reakcije) in glioksilatni del (intermediat)
- Iz dveh acetatov dobimo en sukcinat
- Sukcinat lahko pretvorimo v bolj uporabne spojine – lahko vstopi v mitohondrij in se po Krebsovem ciklu oksidira do malata, ki ga lahko celice porabijo za glukoneogenezo (mitohondriji nimajo transporterja za oksaloacetat, za malat pa imajo)
- Lahko nastane glukoza, ki se porabi za tvorbo celičnih sten iz celuloze
- V nekaterih semen ni dovolj OH, ki pa so potrebni za rast rastlin; glioksilatni cikel je rešitev (cikel ključen za kaljenje)
malat gre lahko iz mitohondrija in se v citosolu oksidira do oksaloacetata (dobimo NADH)
Ali bo potekel glioksilatni cikel ali cikel citronske
kisline?
- Odvisno od energijskih potreb celice (če potrebujemo energijo, teče Krebsov cikel, v nasprotnem primeru se sintetizira glukoza)
- Ponovno regulacija z zunanjimi dejavniki
