12. POGLAVJE: BIOSIGNALIZACIJA Flashcards
Biološka funkcija prenosa signala:
B-limfocit
Dražljaji, ki se lahko prenesejo:
- Varovanje in obramba; npr. sinteza protiteles
o B-limfocit spozna virus
o Ima B-celične receptorje (imunoglobuline), ki spoznajo virus (vsebuje vezavno
mesto, neke proteine)
o B-limfociti dobijo signal, da se namnožijo in ustvarijo veliko količino protiteles
-> proliferacija (razmnožijo se celice) in diferenciacija (spremeni se program v
celici – nastane B-celica plazmatka)
o Kako se je limfocit diferenciiral na molekularnem nivoju? Prišlo je do regulacije
transkripcije določenih genov - Rast in spremenjen metabolizem
o Ali imamo dovolj aminokislin, OH…? Če ja, se lahko deli, drugače je potrebno varčevati z energijo (lahko potekajo različni programi, različno intenzivne
metabolne poti)
Dražljaji, ki se lahko prenesejo:
* antigeni
* hormoni
* nevrotransmiterji
* svetloba
* otip
* feromoni…
Kaj je receptor
skupine receptorjev
Receptor: Na membrano vezan ali topen protein/proteinski kompleks, ki po vezavi liganda povzroči nek fiziološki efekt
Skupine receptorjev:
* receptorji sklopljeni z G-proteinom – receptor adrenalina (epinefrina)
* z encimi povezani receptorji – inzulinski receptor
* z ligandi regulirani* ionski kanali* – nikotinski acetilholinski receptor
* drugi membranski receptorji – receptorji integrina
* jedrni receptorji – steroidni receptorji
Inzulinski receptor
Inzulinski receptor: ekstra in intracelularna domena, razteza se preko membrane
Vezava inzulina -> domeni se zbližata, zanka pride v aktivno mesto kinaze -> fosforilacija
AKTIVACIJSKA ZANKA na tirozin kinazi
zaradi fosforilacije zanka ne zapira več aktivnega mesta
vežejo se lahko različni substrati, ki imajo Tyr
5 ključnih lastnosti za prenos signala
SPECIFIČNOST: določene specifične molekule jih aktivirajo
* Celice imajo več istovrstnih receptorjev
* Iste celice imajo lahko različne receptorje, različne celice imajo lahko enake receptorje, a delujejo npr. na drugačen način (nekje apoptoza, drugje se začnejo deliti)
OJAČITEV SIGNALA: proizvede se veliko sekundarnih sporočevalcev
MODULARNOST: signali lahko pridejo iz različnih virov, lahko pride do različnih kombnacij
DESENZITACIJA: pomembno vlogo ima povratna zanka (signal se lahko tudi prekine)
* Desenzitacija paličic in čepkov recimo ko pridemo v zelo svetel prostor in se potem oči navadijo
INTEGRACIJA: celice se usklajujejo, če imamo nasprotujoče si signale
Receptorji vežejo specifične ligande
Naštej tipične ligande.
Tipični ligandi so:
* majhni ioni
– železov ion: npr. v bakterijskem Fe receptorju
* organske molekule
– adrenalin (=epinefrin): epinefrinski receptor
* polisaharidi
-heparin: fibroblastni rastni faktor
* peptidi
– inzulin: inzulinski receptor
* proteini
– endotheljski rastni faktor: VEGF receptor
Vežejo se nekovalentno:
največ ionske (elektrostatske), lahko tudi Van der Waalsove, vodikove
slika:
modra – pozitivni elektrostatski potencial
rdeča – negativni elektrostatski potencial
VEZAVA RECEPTOR – LIGAND preučevanje
*ravnotežje vezave označenega (npr. radioaktivno) liganda z receptorjem
* če se vežeta je cel kompleks radioaktiven
* prosti ligand gre lahko skozi filter
* kompleks ne more skozi filter, ker se protein veže nanj
Koraki:
* izolacija membrane
* dodatek liganda k membrani
* filtracija
* spiranje nevezanega liganda
* meritev radioaktivnosti, ki je sorazmerna s količino kompleksa
Scatchard-ova analiza: gledamo, kako hitro vezava doseže nasičenje
Analiza podatkov:
* Lahko določimo disociacijsko konstanto (Kd,
močne vezave, 10-10 M)
Večina liganda je v kompleksu, kar ni v
kompleksu je v redu razreda nanomolov
* Število receptorjev (Bmax – vsa vezavna mesta)
* Kooperativnost
o R+L=RL
o Ka=[RL]/([R][L])=1/Kd
Transmembranski receptorji:
niso sposobni preiti fosfolipidnega dvosloja, zasidrani, prenesejo signal
- Prenos signalov z G-proteini
o Receptorji povezani z G proteini (GPCR) - Tirozin kinazni receptorji
o Fosforilirajo aminokislino tirozin - Guanilil ciklaze
o Imajo znotrajcelično strukturo, ki proizvaja GMP sporočevalec - Ionski kanalčki
o Specifično prepuščajo ione
o Napetostno regulirani (odvisnost od membranskega potenciala) ali od liganda regulirani (odvisnost od specifičnega primarnega sporočevalca, liganda) - Adhezijski receptorji
o Signalizacija poteka v obe smeri (povsod drugje se nekaj veže na zunanji strani in prenese signal v notranjost); lahko pride do vezave molekule tudi znotraj celice - Jedrni receptorji
o Niso v membrani jedra!
o Vežejo hidrofobni primarni sporočevalec in lahko prehajajo lipidni dvosloj,
skupaj lahko potem potujejo naprej, velikokrat regulirajo transkripcijo
- PRENOS SIGNALOV Z G-PROTEINI
Zgradba G-proteinov
GPCR: z G-proteini sklopljeni receptorji
* 7 transmembranskih alfa heliksov (serpentinski receptorji)
* G-proteini so heterotrimerni (αβγ) z membrano-povezani proteini, ki vežejo GTP
α in γ zasidrana v membrano (fiksacija in pravilna orientacija)
* G-proteini prenesejo signal od GPCR do drugih tarčnih proteinov
imajo veliko zank
sodelujejo v beta adrenergični poti
- PRENOS SIGNALOV Z G-PROTEINI
Delovanje G proteinov
- Osnova signalizacije je disociacija αβγ trimera po aktivaciji reeptorja
- Ko se receptor aktivira, se vezan GDP zamemja z GTP v α podenoti
(GTP in GDP se izmenjujeta nastane en iz drugega!!!) - GTP-vezan stimulacijski GαS interagira z adenilat ciklazo in jo aktivira (v primeru β-
adrenergične receptorske signalne poti, ki poteka v jetrih)
Ko je notri GTP: Zanki se lahko povežeta, nastane bolj aktivna podenota, ki je bolj kompaktna
o Proizvaja se ciklični AMP (cAMP) zaradi vezave na adenilat ciklazo.
o Ciklični AMP je sekundarni sporočevalec
* Čez nekaj časa alfa podenota razgradi GTP, zanki se razvežeta, ne more se
več vezati na adenilat ciklazo, signal je prekinjen.
- PRENOS SIGNALOV Z G-PROTEINI
Delovanje G proteinov
Kako pride do konformacijskih sprememb?
- Imamo RAS in helikalno domeno, gleda se razdalja med njima
o Razdalja se poveča, ko je vezan aktiviran receptor - Ugotovili so, da se kompleks stalno odpira in zapira in da je večino časa zaprt
- Alfa heliks 5 je ključen pri vezavi GDPja – nekovalentno se veže in stabilizira
- Tudi, ko se domeni razkleneta, se GDP drži noter in še ne gre takoj proč
- Alfa heliks 5 se mora premakniti, da gre
GDP stran - Ko se veže GTP se alfa podenota aktivira, pride do razpada kompleksa
- Alfa sedaj aktivira druge encime (npr. za izgradnjo cAMP)
- Razpad: hidroliza GTP
cAMP
* Aktivira druge proteine, največkrat je to encimi kinaza
- PRENOS SIGNALOV Z G-PROTEINI
Primeri delovanja G proteinov
ADRENALIN (EPINEPHRINE): HORMON AKCIJE
agonist
antagonist
- Sinteza v nadledvični žlezi, odziv na stres, potrebna je energija
- Adrenergeni (adrenalinski) receptorji – beta adrenergeni receptorji
- Maščobne kisline -> glukoza
- Vezava na receptorje v mišičnih in jetrnih celicah inducira razgranjo glikogena
- Vezava na receptorje maščobnih celic inducira hidrolizo lipidov
- Vezava na receptorje celic v srcu poveča utrip srca – glukoza hitreje pride do tarče
agonist – molekula podobna primarnemu sporočevalcu, ki se veže na receptor in posnema naravne ligande
* npr. isoproterenol
se boljše veže kot adrenalin in ima isto funkcijo
antagonist- molekula podobna primarnemu sporočevalcu, ki se veže na receptor in ne sproži signala in s tem blokira efekt agonistov
* npr. propranolol
ne pride do signalizacije, zasede vezavno mesto in prepreči vezavo primarnemu sporočevalcu
- PRENOS SIGNALOV Z G-PROTEINI
VPLIV NA GTP-GDP izmenjavo
GTP – GDP izmenjevalni faktorji
* Sos – gvanozin exchange faktor / sun of sevenless
če bo GTP, bo aktiven G protein
GTPazna aktivnost – modulatorji
* GAP – proteini, ki aktivirajo GTPazno aktivnost
* RGS – regulatorji G proteinske signalizacije alfa podenote
- PRENOS SIGNALOV Z G-PROTEINI
cAMP (morš znat narisat!)
cAMP (morš znat narisat!)
nastane iz ATP prek adenilat ciklaze
je cikličen AMP
* sekundarni obveščevalec
* cAMP fosforilira druge proteine (protein kinaza A), a ne vseh po vrsti
o hidroksilna skupina (serin, treonin, tirozin)
* alosterično aktivira od cAMP-odvisno protein kinazo A (PKA)
o to vodi do aktivacije encimov, ki katalizirajo razgradnjo glikogena do glukoze
cAMP je splošni sekundarni prenašalec
* veliko število GPCR povezanih signalov se prenese preko cAMP
* okoli 500 GPCR je namenjenih za zaznavanje vonja in okusa
* mnogo ligandov za GPCR še ni identificirnanih
- PRENOS SIGNALOV Z G-PROTEINI
Primeri delovanja G proteinov
ADRENALINSKA KASKADA
ADRENALINSKA KASKADA
ojačitev signala
* aktivacija GPCR vodi do aktivacije več molekul adenilat ciklaze
* vsaka aktivna adenilat ciklaza sintetizira več cAMP -> aktivacija encimov PKA
* aktivacija encimov, ki razgrajujejo glikogen
* sprostitev več 10000 molekul glukoze
avto-inaktivacija beta adrenergičnega signala
* adrenalin naj bi bil signal s kratkim časovnim delovanjem
* organizem mora zaustaviti sintezo glukoze, če ni več potrebe zanjo
* hidroliza GTP v alfa podenoti G proteina povzroči zmanjšanje koncentracije cAMP
cAMP se v celici razgradi
- PRENOS SIGNALOV Z G-PROTEINI
zmanjšanje občutljivosti beta adrenergičnih recpeptorjev
4 procesi:
- hidroliza GTP
- hidroliza cAMP
- zmanjšanje koncentracije
-desenzitacija ali
zmanjšanje občutljivosti beta adrenergičnih recpeptorjev
- celica skrije receptor v celico
- beta gama podenota proteina, gor se lahko veže beta ARK, fosforilacija C-konca, gor se lahko veže beta arr (arrestin)
- pride do endocitoze (vezikli
z receptorji, ki so v celici), celica je desenzitirana
- PRENOS SIGNALOV Z G-PROTEINI
Primeri delovanja G proteinov
Nekateri bakterijski encimi
deaktivirajo G-proteine
- če deaktivirajo GTPazna aktivnost alfa podenote proteina, to povzroči, da je adenilat ciklaza vedno aktivna in proizvede preveč cAMP iz ATP
- primer je Cholera (lahko dehidriraš), tudi oslovski kašelj
Cholera toxin
* patogen producira toksine, ki se vežejo na G proteine
dimerni protein
* podenota B se veže na specifične receptorje epitelnih črevesnih celic, odpre se pot za podenoto A, da lahko vstopi v celico
* A1 se poveže skupaj z ADP-ribozilatskiim faktorjem ARF6 (majhen G protein v gostiteljski celici) preko regij switch I in II
samo od tu naprej je na ppt
* posledica je prenos ADP-riboze od NAD+ do Arg v P loopu alfa podenote Gs
torej ADP-riboza se veže na Gs preko Arg
* !!!ADP-ribozilacija prepreči aktivnost GTP-aze, kar povzroči nenehno delovanje adenilat ciklaze, visoko koncentracijo cAMP in povišano aktivnost PKA
* PKA fosforilira Cl- kanalček in Na+ izmenjevalec, kar povzroči dehidracijo
(izguba vode zaradi osmoze)
- PRENOS SIGNALOV Z G-PROTEINI
Primeri delovanja G proteinov
GPCRs in FOSFOLIPAZA C
GPCRs in FOSFOLIPAZA C
prenos preko fosfolipaze C
* encim, ki cepi fosfolipide v celični membrani (cepi PIP2)
(poznamo tudi A1, A2 in D fosfolipaze)
- ko se nek ligand veže na GPCR, lahko to vodi do aktivacije fosfolipaze C
- fosfolipaza C je specifična za fosfolipide PIP2 (fosfoatidilinozitol 4,5-bisfosfat) in jih cepi do DAG (diacilglicerol; ostane v membrani) in IP3 (inozitol 1,4,5- trifosfat; je sekundarni
sporočevalec) - IP3 se veže na IP3/Ca2+ kanalček na ER, kar povzroči, da se kalcij sprosti v citosol, koncentracija naraste
- kalcij in DAG aktivirata encim kinazo C, kar povzroči forsforilacijo tarčnih proteinov
- Z ENCIMI POVEZANI MEMBRANSKI RECEPTORJI
Zgradba
Delovanje
Zgradba membranskih receptorjev povezanih z encimi:
* Ektracelularna domena, ki veže ligande in intracelularna katalitična domena
o Ekstracelularna domena specifično veze sporočevalec, to povzroči aktivacijo
o Domene omogočajo interakcije (npr. IgG domene)
Delovanje receptorjev povezanih z encimi
katalitična domena
*TIROZIN KINAZNA AKTIVNOST
o Doda fosfoatno skupino sama sebi
o Avtofosforilacija povzroči spremembe v strukturi, kar omogoči vezavo in fosforilacijo specifičnih tarčnih proteinov
o Doda fosfatno skupino na Tyr substrat
* GVANILIN CIKLAZNA AKTIVNOSTt
o Pretvorijo GTP v cGMP, ki je sekundarni prenašalec
- Z ENCIMI POVEZANI MEMBRANSKI RECEPTORJI
TIROZIN KINAZNI RECEPTORJI (RTKs)
TIROZIN KINAZNI RECEPTORJI (RTKs)
* Receptorji za rast, ki delujejo s pomočjo tirozin kinazne aktivnosti imajo tirozin kinazno domeno obrnjeno proti citoplazmi
* Zunajcelične domene so odvisne od tipa receptorja
o Navadno kombinacija s cisteinom ali leucinom bogatih segmentov in
segmentov značilnih za imunoglobuline
INS-R: receptor za inzulin
VEGF-R: vaskularni epidermalni rastni faktor
PDGF-R: rastni faktor iz trombocitov
EGF-R: epidermalni rastni faktor
NGF-R: živčni rastni faktor
FGF-R: fibroblastni rastni faktor
- Z ENCIMI POVEZANI MEMBRANSKI RECEPTORJI
Primeri delovanja
INZULINSKI RECEPTOR INS-R
INZULINSKI RECEPTOR INS-R
Inzulin: hormon vnosa glukoze in metabolizma
* sintetizirajo ga beta celice Langerhansovih otočkov v pankreasu
* inzulin se sintetizira in sprosti iz pankreasa kot odziv na hrano, kot je npr. glukoza
* pride do tarčnih celic po krvnem obtoku
* vezava inzulina na receptor povzroči kaskado dogodkov, ki vodijo k povečanemu sprejemu glukoze in metabolizmu
* nezmožnost sinteze ali zaznavanja inzulina vodi v diabetes (diabetes tipa 1)
Inzulinski receptor se aktivira, ko se nanj veže inzulin
* Dimer, zanka se malo premakne
* Glukozni transporterji pridejo na membrano, ko se inzulin veže na receptor
* GLUT4 se skrijejo in lahko pridejo na površje, GLUT2 pa so recimo v jetrnih celicah stalno na površju
* vezava inzulina aktivira katalitično domeno
* katalitična domena ene kinaze fosforilira Tyr v sosednji domeni
* receptorska avto-fosforilacija omogoča vezavo in fosforilacijo IRS-1 proteina
* posredna interackija fosforiliranega IRS proteina z Ras proteinom povzroči celo serijo fosforilacij proteinov
o Raf-1, MEK, ERK
* ERK (fosforilirana proteinska kinaza) vstopi v jedro
* transkripcijski faktor Elk1 se fosforilira in povzroči ekspresijo specifičnih genov
glukozni transporter (GLUT4)
Regulacija izražanja genov s pomočjo
inzulina preko MAP kinazne kaskade reakcij
* ISN-R je sestavljen iz dveh alfa podenot (zunaj) in dveh beta podenot (znotraj)
* Vezava inzulina na alfa podenoto povzroči konformacijske spremembe in avtofosforilacijo Tyr predela v beta podenoti
* Aktivira se tudi Tyr kinazna domena, ki katalizira fosforilacijo tarčnih proteinov
* Regulacija poleg INS-R vključuje tudi druge kinaze (npr. MEK, ERK)
- Z ENCIMI POVEZANI MEMBRANSKI RECEPTORJI
Primeri delovanja
GLIKOGEN SINTAZA in INZULIN
Kovalentna modifikacija (izpitno vprašanje!!)
* Če je inzulin prisoten, mora biti glikogen sintaza aktivna
* Poleg Grb2 proteina (omenjen prej), se lahko na fosforiliran IRS-1 veže tudi
PI-3 kinaza preko SH2 domene
o PI-3K pretvori PIP2 v PIP3K
* Protein kinaza B (PKB) se lahko veže z PIP3 in se tako fosforilira s pomočjo PDK1
* Fosforilirana PKB fosforilira GSK3 (glikogen sintaza kinaza 3)
o GSK3 je tako inaktivirana (zaradi fosforilacije), ne more pretvoriti GS v neaktivno
obliko
o GS sintetizira glikogen
* Če ne bi bil prisoten inzulin, ne bi prišlo do deaktivacije GSK3, ki lahko inaktivira GS (glikogen se ne bi proizvajal)
* PKB sproži tudi spremembe v GLUT4 transporterjih, poveča se vnos glukoze v celice iz krvi
- Z ENCIMI POVEZANI MEMBRANSKI RECEPTORJI
Primeri delovanja
JAK-STAT TRANSDUKCIJSKI MEHANIZEM ZA ERITROPOETINSKI RECEPTOR
FOSFORILACIJSKO ODVISNE PROTEINSKE INTERAKCIJE V SIGNALNIH POTEH
JAK-STAT TRANSDUKCIJSKI MEHANIZEM ZA ERITROPOETINSKI RECEPTOR
- Tyr kinaza (JAK) je aktivirana ob vezavi z receptorjem
- JAK fosforilira transkripcijski faktor STAT (lahko tvorijo
dimere), ki nato vstopi v
jedro in vpliva na izražanje genov glede formacije eritrocitov pri sesalcih
FOSFORILACIJSKO ODVISNE PROTEINSKE INTERAKCIJE V SIGNALNIH POTEH
* Veliko signalnih proteinov ima domene, ki vežejo fosforilirane Tyr, Ser ali Thr predele drugih proteinov
* SH2-domene in PTB (fosfotirozin vezavne) domene vežejo proteine s fosforiliranim tirozinom
* SH3 in PH domene vežejo membranske fosfolipide PIP3
Modularna struktura signalnih proteinov
- Domena – globularna struktura, ki ima neko funkcijo (neke funkcionalne enote z definirano 3D strukturo) - naštej 5 domen in njihovo funkcijo
PIP3
Tyr-P
DNA
fosfolipidi - Omogočajo vezavo ali inhibicijo vezave določenih molekul
- IONSKI KANALČKI
lastnosti
- Regulirajo transport ionov skozi celično membrano glede na:
o Spremembe membranskega potenciala
o Vezave ligandov na specifično mesto receptorja - Pomembna vloga v živčnem sistemu
o Napetostno regulirani natrijevi kanali
o Nikotinski acetilholinski receptor
o Glutamatni receptor
o GABA receptor A
