1. Úvod a metody Flashcards
1
Q
Metody pro specifickou lokalizaci struktur
A
- HISTOCHEMICKÉ TECHNIKY:
- ENZYMATICKÁ HISTOCHEMIE:
- IMUNOHISTOCHEMIE:
- IMUNOCYTOCHEMIE:
2
Q
Metody pro specifickou lokalizaci struktur - Histochemické techniky
A
HISTOCHEMICKÉ TECHNIKY:
- Nespecifická i specifická zabarvení
- Nespecifické zabarvení - rozlišuje pouze kyselé/zásadité struktury (cytoplazma, jádro)
- k preparátu je možné přidat reaktanty a přímo v tkáni detekovat strukturu či prvek
3
Q
Metody pro specifickou lokalizaci struktur - Enzymatická histochemie
A
ENZYMATICKÁ HISTOCHEMIE:
- některé enzymy jsou schopné přežít i po zafixování a nařezání tkáně
- když k nim přidáme bezbarvý substrát, který se po reakci s enzymem obarví, můžeme detekovat daný enzym
4
Q
Metody pro specifickou lokalizaci struktur - Imunohistochemie
A
IMUNOHISTOCHEMIE:
- použijeme protilátku, která se specificky váže na určitou molekulu v preparátu
- pro vizualizaci se nejčastěji používá tzv. sekundární protilátka (protilátka proti protilátce), která je označená fluoroforem pro fluorescenční mikroskopii, popř. nesoucí navázaný enzzym schopný po přidání substrátu vznik bareevného nerozpustného produktu, který je pak možné pozorovat díky klasické světelné mikroskopii
5
Q
Metody pro specifickou lokalizaci struktur - Imunocytochemie
A
IMUNOCYTOCHEMIE:
- to co imunohistochemie, jen nás zajímá buněčná úroveň a detekujeme pomocí protilátek jednotlivé b. struktury
6
Q
Příprava vzorku - 1) Odběr tkání a buněk - z čeho, jak
A
- z živého organismu - BIOPSIE
- z mrtvoly - NEKROPSIE, AUTOPSIE
- nutnost provést fixaci, jinak se tkáň rozloží - AUTOLÝZA
- blok tkáně max. 1 cm3
- KRYOFIXACE - zmrazení
- PERFUZE - ještě do živého zvířete se napustí fixační činidlo (např. formaldehyd), to okamžitě ztuhne
7
Q
Příprava vzorku - 2) Fixace - proč, fyzikální a chemické metody
A
- zastaví metabolické děje v buňce buď jejich zpomalením nebo denaturací enzymů
- Fyzikální metody: teplo, zmražení
- Chemické metody: imerzní (ponoření do fixační tekutiny), perfuzní (nástřik cév)
- použití KRYOPRESERVANS - např. sacharóza, ethylenglykol; proniknou do buněk a vytvoří směs, která sice zmrzne, ale zabrání vzniku velkých krystalků
8
Q
Příprava vzorku - 2) Fixace - fixační činidla - co dělají
A
- precipitují proteiny (chlorid rtuťnatý)
- denaturují a síťují proteiny kovalentní modifikací (formadehyd, glutaraldehyd - vazba na NH3 skupiny)
- denaturující a odvodňující preparát - alkoholy
- fixační směsi - pro rychlé a dokonalé fixování - Bouinův roztok, Zenkerův roztok, roztok glutaraldehydu a formaldehydu
- EM - glutaraldehyd + oxid osmičený
9
Q
Příprava vzorku - 3) Zalévání do roztoku
A
- zpevnění preparátu
- pryskyřice, parafín, zmražení
- pryskyřice, parafín - je třeba odvodnit -> VZESTUPNÁ ŘADA ALKOHOLŮ
10
Q
Příprava vzorku - 4) Krájení
A
- řezy o tloušťce jedné vrstvy buněk - 4-10 mikrometrů
- přístroje = MIKROTOMY
- řezy na podložní sklíčko, kde se teplem natáhnou
- Druhy mikrotomů: mikrotom, ultramikrotom, vibratom, kryomikrotom
- Parafínové bločky - řez ocelovým nožem
- Pryskyřicové bločky - řez skleněným/diamantovým nožem
- zmrazovací mikrotom - použití bez fixace a zalévání, rychlé, využití v klinice, bez denaturace, možnost histochemických stanovení, nože ocelové, skleněné, diamantové
11
Q
Příprava vzorku - 5) Barvení - jak, typy barviv
A
- zviditelnění buněčných struktur a tkání
- většina barviv rozpustných ve vodě (odstranit parafin a zavodnit sestupnou řadou ethanolu)
- po obarvení montování do pryskyřic
- nenavázané barvivo se odstraní omývání dH2O
- BARVIVA:
- > BAZOFILNÍ STRUKTURY - samy jsou kys. povahy, mají záporný náboj, barví se bazickými barvivy (haematoxylin, toluidinová a methylenová modř)
- > ACIDOFILNÍ=EOSINOFILNÍ STRUKTURY - zásadité povahy, kladný náboj, cytoplazma a některé druhy granul, barví se kyselými barvivy (oranž G, eosin)
12
Q
Příprava vzorku - 5) Barvení - příklady barviv + vitální barvení, fluorescenční techniky
A
- PŘÍKLADY:
-> EOSIN: kyselé barvivo, váže se na + pomocí H můstků, cytoplazma
-> GIEMSA (Leishman): např. krevní roztěry
-> PAS barvivo: barví (-) nabité makromolekuly - muciny, GAG, sacharidy, polysacharidy, glykolipidy…
-> NISSLOVA SUBSTANCE: nervové buňky, neuronové a gliové sítě, modrá
-> AZAN: kombinace několika barviv, azokarmín - jádra červeně, anilínová modř - kolagenní vlákna a mucin modře, Oranž G - cytoplazma a svaly, Erytrocyty jsou červené
-> WEIGERT - VAN GIESON: Weigertův hematoxylin barví jádra šedě, Saturnová červeň - kolagenní vlákna červeně, Kyselina pikrová - cytoplazma buněk a svalovina žlutě
-> ŽLUTÝ MASSONŮV TRICHOM: Hematoxylin - modrá/černá jádra, Erytrosin - červená svalovina, Šafrán - žlutá kolagenní vlákna, Erytrocyty - červené
-> ZELENÝ MASSONŮV TRICHOM: Hemtatoxylin - modrá/černá jádra, Kyselý fuschin - červená svaloviny, Světlá zeleň - zelená kolagenní vlákna, Erytrocyty červené - VITÁLNÍ BARVENÍ:
= barvení živých buněk
-> NEUTRÁLNÍ ČERVEŇ - bezbarvá a permeabilní do uněk, neprotonovaná, s protony se setká např. v lysozomech - protonovaná se obarví červeně a už nemůže procházet membránami
-> JANUSOVA ZELEŇ - bezbarvá a permeabilní, když je neoxidovaná, oxidovaná zezelená, obarvování mitochondrií - FLUORESCENČNÍ TECHNIKY:
-> výhoda: můžeme pararelně od sebe pozorovat několik struktur, vznikne vícebarevný preparát
13
Q
Histochemie - definice, kritéria vznikajících produktů, příklady
A
= využití chem. reakcí k vizualizaci struktur
- vznikající produkty:
- > nesmí difundovat z místa vzniku (pak bychom obarvili vše)
- > musí být nerozpustné, barevné a elektrodenzní
- > metoda musí být specifická
- > fixace nesmí blokovat funkční skupiny nebo ničit funkci prokazovaných enzymů
- Příklady histochemických reakcí - Železo, Fosfáty, DNA, Proteiny, Polysacharidy a oligosacharidy, Glykolipidy a glykoproteiny
14
Q
Histochemie - detekce enzymů
A
- Kyselá fosfatáza - Gomoriho metoda - fixace formalínem, inkubace s glycerolfosfátem sodným a dusičnanem olovnatým, generace fosfátových iontů a vznik nerozpustného elektrodenzního fosforečnanu olovnatého - průkaz lysozomů
- Dehydrogenázy - tetrazolium - redukce na barevnou sraženinu formazanu - detekce mitochondrií
- Perxxidáza - využití DAB 3’diaminobenzidinul který v přítomnosti reaktivního kyslíku (který vznikne pomocí peroxidázy z H2O2) udělá hnědé zabarvení, pozorování protilátek značených peroxidázou
15
Q
Histochemie - Průkazové reakce
A
- Elektronmikroskopická autoradiografie - imunocytochemie, lektinová histochemie, hybridizace in situ, metabolické radioaktivní značení
- Elektronová mikroskopie se dá propojit s autoradiografií -> studium biochemické dynamiky přeměn různých metabolitů, které mohou být radioaktivně označeny; např. studium putování nově syntetizovaných proteinů GA a sekreční dráhou
