1. Secuenciación masiva de genomas

Question 1

¿Qué es la secuenciaciónde ADN?

Answer 1

Metodología basada en procesos químicos para determinar el orden de los nucleótidos en el ADN

Question 2

Método de secuenciación en 1977

Answer 2

• Por Sanger
• Basado en agg ddNTPs

técnica de secuenciación de primera generación

Question 3

¿Cuál es la función de un ddNTPs?

Answer 3

Detienen la extensión de la cadena porque no pueden formar un enlace fosfodiéster con el siguiente nucleótido

Question 4

¿Por qué los ddNTPs no puede unirse al siguiente nucleótido?

Answer 4

no tienen OH en C3´ en su desoxirribosa por lo que no se pueden unir al gpo. fosfato del sig. nt.

Question 5

Fundamento de la secuenciación de Sanger

Answer 5

• Replicación con ADN polimerasa
• Crea cadenas de ADN de varias longitudes que serán separadas por tamaño por electroforesis

Question 6

Metodología de secuenciación de Sanger

Answer 6

• ADN polimerasa amplificará cadena sencilla
• Lectura fragmentos de 50-300 nucleótidos
• Separación de cadenas por diferentes ddNTPs

Question 7

Diferencia entre si se une un nucleótido normal y un ddNTPs

Answer 7

• Nucleótido: la cadena seguiría de forma normal, cadenas completas
• ddNTPs: la cadena se cortará, es aleatorio y crea fragmentos de diferentes longitudes de la cadena

Question 8

¿Qué lado de la cadena tendrán todos en común?

Answer 8

El extremo 5´, porque los extremos 3´variarán dependiendo del ddNTP que se le una

Question 9

Next generation secquencing: tipos de ténicas nuevas

Answer 9

• Por hibridación: 454 pirosecuenciación SOLID (rocher) y solexa (illumina)
• Por secuencia de una sola molécula en tiempo real: SMRT

Question 10

Facts de secuenciación automatizada por fluorescencia

Answer 10

• 1990
• Uso de 4 colorantes (dif longitudes de ondas) en cuatro reacciones específicas de base
• Un solo pocillo
• Detección de onda por medio de laser y envian info a compu

Question 11

Facts de pirosecuenciación

Answer 11

• Lee las secuencias a la misma vez que se van creando
• No usa gel
• 200-400 pb
• Nucleótido correcto unido = luz
• dNTPs no unidos serán degradados por apirasa
• Más rápida
• Más precisa

Question 12

Proceso de la pirosecuenciación masiva

Answer 12

1. ADN se corta en fragmentos cortos y preparan plantillas de ADN de cadena sencilla
2. Se añaden adaptadores a los extremos del ADN
3. Fragmenos se unen a esféras (aprovechando la unión biotina-estreptavidina)
4. en gotas de emulsión = fragmentos (amplificandose) + esfera
5. Después de amplificación, se rompen las gotas y colocamos esferas en pocillos
6. Lava secuencia fija de nucleotidos sobre esfera y detecta luz producida a la unión de nucleótidos

Question 13

Proceso de como se hace la luz en pirosecuenciación

Answer 13

1. ADN pol añade nucleótido, si es el correcto, se libera pirofosfato (PPi)
2. PPi → ATp (por ATP sulfuroilasa)
3. ATP + enzima luciferasa → genera luz
4. Cantidad de luz indica cantidad de ATP = nucleótido que se incorporó

Question 14

Facts de PCR en embulsión Ion Torrent

Answer 14

• Adaptadores están ligados a extremos de fragmentos de ADN de biblioteca (adaptadores permiten que fragmentos se unan a perlas de embulsión)
• En un único tubo, mezcla oleosa + frag ADN + perlas + PCR (perlas = macrorreceptores para PCR)
• PCR conduce a amplificar cada gota

Question 15

En la PCR en embulsión Ion Torrent se liberará esto cada que se una un aa

Answer 15

Pt-

primer terminal

Question 16

Facts de solexa

Answer 16

• Por Illumina
• Amplificación en puente o cluster PCR
• Los fragmentos de ADN se unen a la superficie de las flow cells porque tienen nt. complementarios con los adaptadores.

Question 17

Dos conceptos claves para entender la tecnología del next generation secuencing

Answer 17

• Cobertura: promedio de número de lecturas que se alinean a una seucuencia de referencia (horizontal)
• Profundidad: número de veces que ha sido secuenciado una base en genoma (vertical)