03 Mutation and Repair

Question 1

Learning Objectives:

Explain the principle and application of the Ames test.

Answer 1

Mutagenic activity.

• Auxotrophic bacterial strain
(e.g. histidine-negative Salmonella enterica)
• Requires specific substrate for growth (e.g. histidine)
• Strain can revert back to wild type by simple mutation
• Add rat liver extract to mimic human metabolic impact

Mutationsrisiko kann bestimmt werden.
Bakterien die ein bestimmtes Substrat benötigen um zu wachsen.
Das Gen was das Substrat herstellt ist mutiert=inaktiv=bekannter Fehler.
Man misst nicht die Fehler-verursachende Mutation sondern die Fehler-umkehrende Mutation!
Natürliche Mutationen sind möglich.
Man testet das mögliche Mutagen, inkubiere das Bakterium mit dem Mutagen -Einfluss, wiederhole den Prozess und misst ob man mehrere Kolonien hat.
Problem: erst durch Modifizierung kann es ein Mutagen werden (Leber).
Isolation von nicht mehr lebenenden, aber aktive Rattenleberzellen mit Enzymen und die Inkubation mit der Testkomponente (annähernd der physiologische Einfluss simuliert). Messung der Veränderungen der Kolonie.

Die mutagene Substanz ist schädlich = wenn der mutagene Einfluss zu groß ist, können die Zellen nicht richtig wachsen = geringere mutagene Aktivität = starke Mutation.

Question 2

Learning Objectives:

List the most important DNA-damaging agents and the type of damage that they induce.

Answer 2

(Folie 9)

Röntgenstrahlen:
Oxigenradikale
Spontante Reaktionen
=
Uracil
Einzelstrang-Bruch
=Base-excision repair (BER)

UV-Licht:
Polyzyklische aromatische Verbindungen
=
Aggregierung mit Basen und Veränderung der Struktur, keine Polymerase /Enzym kann die DNA-Sequenz ablesen.
= Nucleotide-excision repair (NER)

Starke Röntgenstrahlen:
Anti-TUmor-Agenten
=
Doppelstrangbruch
= Recombinational repair (HR, EJ)

Repkikationsfehler
=
A-G / T-C misstatch
Insertion
Deletion
= 
Mismatch Repair

Konsequenzen

Inhibition von:
Transkription
Replikation
Chromosom Segretation (Trennung)
= Apoptose
Mutationen
Chromosomeaberration (Veränderungen)
= Krebs

Die Zelle testet ständig den Status ihrer Integrität.
Checkpoints.
Apoptose.

Overview

• Causeofcancer (mutagen~carcinogen)
Mutagen: schädigt und verändert die DNA > führt zu Krebs (Reperaturprozesse)

• Spontaneous mutations
– replication error
– recombination
– hydrolysis (Zellen im wässrigen Milleu, Wasser ist polar und hat eine reaktive Eigenschaft)

• Mutations caused by mutagens
– physical mutagens (UV, radiation, asbestos)
– chemical mutagens (e.g. tobacco smoke, aflatoxin)
– viral mutagens (human papillomavirus)

Question 3

Learning Objectives:

Describe the principles of photoreactivation, base excision repair, nucleotide excision repair, mismatch repair and double-strand break repair.

Answer 3

(2) by Non-homologous End Joining

Pyrimidine dimers (1)
Thymine dimer:
• primary cause of melanoma

Pyrimidine dimers (2)
Cyclobutane thymine dimer und 6-4 Photoprodukt.
• direct repair by photoreactivation, catalyzed by photolyase + visible light (bacteria, plants)
• or by nucleotide excision repair (mammals)

= Die Polymerase kann nicht mehr ablesen

Base Excision Repair:
(Single strand breaks, AP sites)
• apurinic / apyrimidinic (AP) sites
• Displacing DNA synthesis (Nick translation!)

= Stang wird durch Endonuklease (innerhalb de DNA) geschnitten.
DNA-Polymerase durch nick translation.
Ligase verknüpft und der Fehler ist behoben.

Nucleotide Excision Repair:
• Deficiency leads to Xeroderma pigmentosum (“children of the night”)
=
Enzyme testen die Struktur: DNA ist verbogen.
An beiden Seiten wird der betroffene Strang unterbrochen. DNA Helikase löst die Doppelstrangbindung und dissoziiert das Fragment was herausge”schnitten” wird.

Mismatch Repair:
Replication errors
Strand-specific repair directly after replication
• Prokaryotes: hemi-methylated dsDNA
• Eukaryotes: (probably) nicks in lagging strand
=
Feststellung des falschen Strangs:
Wenn die Repiklation abgeschlossen ist aber die Methylierung noch nicht stattgefunden hat, kann das Reparatursystem aus MutH, MutS und MutL den Fehler erkennen, eine GATC-Sequenz erkennen die hemimethyliert ist, beide Informationen miteinander verknüpfen, den fehlerhaften Strang identifizieren und reparieren.
Räumliche Distanzen müssen überbrückt werden.
3 Unterschiedliche Proteine:
MutS: erkennt den Fehler und bindet die Fehlpaarung.
MutH: erkennt die GATC-Sequenz die hemimethyliert ist.
MutL: als Verknüpfer der beiden Protein-DNA-Komplexe und teilt dem Enzym mit wo sich das Problem befindet.
Nicks werden eingeführt.

Double Strand Break Repair (1) by Homologous Recombination
• homologous recombination (HR)
• DSBR: double-strand break repair
• SDSA: synthesis-dependent strand annealing
=
Starke Schädigung, hohes Risiko an Mutationen:
Das menschliche Genom enthält viele Kopien und sind repetitiv.
Ähnliche Sequenz (Chromosome oder Kopie des Genom Bereiches) dient als Vorlage.

Der Fehler ist so gravierend, dass Enden in räumlicher Nähe miteinander verknüpft, auch auf die Gefahr dass etwas fehlt oder falsch ist.

Spontane Deamination:
Cytosin wird zu Uracil und kommt in der RNA und nicht in der DNA vor.
T-G Fehlpaarung die nicht effizient repariert werden können.
Reparatur: zeitversetztes Fenster der Methylierung.

Depurination:
Nur durch die base excision repair. Wenn biologisches DNA Material nicht verwendet wird.

Question 4

Learning Objectives:

Discuss the importance of BRCA1/2, p53 and chemotherapy.

Answer 4

(Folie 21)

Funktion: Reparatur für Doppelstrangbrüche. Diagnostische Relevanz: Höhe des Risikos von Brust-, Eierstock-, Pankreaskrebs.

Tumorsupressor-Gene.

• BRCA1, BRCA2 tumor suppressor genes
– DNA repair defects (mostly DSBR)
– increased risk of breast and ovarian cancer
=
Verursachen nicht selbst Krebs (wie typische Onkogene) sondern den Krebs verhindern können dadurch dass sie an Reparatur beteiligt sind.
Suppremieren den Tumor = erhöht die WK von Krebs

• p53 tumor suppressor gene
– cell cycle regulator
=
An Checkpoints wird kontrolliert und eventuelles Anhalten und Zelltod.

• SOS response (Prokaryotes)
– global response to DNA damage
(ähnlich wie beim Zellzyklus AIDS-Test)

• chemotherapy / radiotherapy
– inducing cell damage and apoptosis 
– impairing fast-dividing (tumor) cells
=
Gewollte und (so gut wie möglich) gezielte DNA-Schädigung 

Die Substanzen sind selbst mutagen.
Nach Chemo kann die DNA so geschädigt sein, dass ein andere Krebs auftaucht.