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Ames Test
Was kann dadurch bestimmt werden? Was wird verwendet? Was wird benötigt? Was misst man? Sind natürliche Mutationen möglich? Was wird letztendlich getestet? Was ist das Problem? Ab wann ist die mutagene Substanz schädlich?
Mutagenic activity.
• Auxotrophic (benötigt Hilfe) bacterial strain
(e.g. histidine-negative Salmonella enterica)
• Requires specific substrate for growth (e.g. histidine)
• Strain can revert back to wild type by simple mutation
• Add rat liver extract to mimic human metabolic impact
Das Mutationsrisiko kann bestimmt werden.
Bakterien die ein bestimmtes Substrat (Histidin) benötigen um zu wachsen.
Das Gen was das Substrat herstellt ist mutiert=inaktiv=bekannter Fehler.
Man misst nicht die Fehler-verursachende Mutation sondern die Fehler-umkehrende Mutation!
Natürliche Mutationen sind möglich. (Spontanmutationen)
Man testet das mögliche Mutagen, inkubiere das Bakterium mit dem Mutagen -Einfluss, wiederholt den Prozess und misst ob man mehrere Kolonien hat.
Problem: erst durch Modifizierung kann es ein Mutagen werden (Leber).
Isolation von nicht mehr lebenenden, aber aktive Rattenleberzellen mit Enzymen und die Inkubation mit der Testkomponente (annähernd der physiologische Einfluss simuliert). Messung der Veränderungen der Kolonie.
Die mutagene Substanz ist schädlich = wenn der mutagene Einfluss zu groß ist, können die Zellen nicht richtig wachsen = geringere mutagene Aktivität = starke Mutation.
Bsp. Bild: stark bei Kreiswachstum, schwach bei enger Bewachsung = tolerable Mutagen-Konzentration
DNA Zerstörungen durch:
Thymin-Dimere Spontane Deamination Apurinische Base Mismatch Repair Doppelstrangbruch
DNA-Zerstörung:
Thymin-Dimere
Was verursachen Pyrimidin-Dimere?
Wie wir die beschädigte DNA erkannt?
Reparatur durch?
Welches Enzym trennt den Doppelstrang?
(Hauptsächlich Thymin und Cytosin)
Melanome.
DNA Läsion ist eine Verformung und zeigt die Zerstörung an.
Nucleotide exision repair (kompletter Nukleotid wird entfernt). DNA Helikase (Enzym) trennt den Doppelstrang.
DNA-Zerstörung:
Apurinische Base (AP site)
Was fehlt in der Ribose? Wie kann es repariert werden? Ist der Fehler häufig? Was schneidet hier die DNA? Durch was wird der Fehler behoben?
Es fehlt eine Base in der Ribose.
Reparatur durch dsDNA = Base wird ausgeschnitten
(base excision repair BER).
Der Fehler ist häufig wenn DNA “herumliegt” also nicht konserviert wird.
= Forensik/Fossile
ssDNA (während der Replikation) = gesamter Kontext des DNA-Strangs mutation
Die AP Endonuklease schneidet innerhalb des DNA-Stranges.
Der Fehler wird durch die Polymerase und anschließende Ligase behoben.
(Nick translation)
DNA-Zerstörung:
Mismatch Repair (Replikations Fehler)
Was ist das Problem?
Welches Enzym erkennt den Fehler?
Welches Enzym erkennt die Sequenz die hemimethyliert ist?
Welches Enzym verknüpft doe Protein-DNA-Komplexe?
Was wird eingeführt?
Was wird synthetisiert?
Das Problem ist eine Fehlbasenpaarung.
Was ist falsch, was ist richtig? = Methylierung
MutS erkennt die Fehlpaarung und bindet sie.
MutH erkennt die GATC Sequenz.
MutL verbindet.
Nicks werden eingeführt.
Ein neuer Strang wird synthetisiert.
DNA-Zerstörung:
Doppelstrangbruch (1) - homologe Rekombination
Durch was ausgelöst?
Problem?
2 Mechanismen um die Doppelstrangbrüche zu lösen.
Was passiert hier dabei?
Durch Röntgenstrahlen.
Durch den Verlust ist nicht klar was fehlt oder welche Enden zusammengehören.
1) Es gibt mehrere Kopien der gleichen DNA
2) Viele Bereiche sind repetitiv (sich wiederholend)
= ähnliche Sequenzen werden als Vorlage verwendet
= homologe Rekombination
- DSBR: double-strand break repair
- SDSA: synthesis-dependent strand annealing
DNA-Zerstörung:
Doppelstrangbruch (2) - non-homologous end joining
Was passiert hier?
Gefahr?
Nicht homologe end joining Reparatur durch Verknüpfung der Enden.
Die Gefahr besteht, dass die Enden nicht zusammengehören oder es etwas fehlt.
DNA-Zerstörung:
Spontane Deamination
Was ist das Problem? Was wird erkannt? Was erkennt es? Was wird herausgeschnitten? Was ist das Problem bei 5-Methylcytosin? Aber?
Die Moleküle befinden sich in einer wässrigen Lösung und reagieren.
)NH2 zu O = Cytosin zu Uracil)
Uracil kommt nicht in der DNA vor.
Uracil-DNA Glykosylase.
Nur die Base wird herausgeschnitten, nicht das ganze Nukleotid.
5-Methylcytosin wird zu Thymin, was aber in der DNA vorkommt und die Reparatur erkennt den Fehler nicht.
Allerdings ist die Methylierung zeitversetzt.
Unterschiede von Prokaryoten und Eukaryoten (hinsichtlich der Transkription).
- Prokaryoten haben eine hohe codieren Dichte.
- Prokaryoten codieren mehrere Gene auf einem mRNA Molekül und einem primärem Transkript codiert werden = polycystronic mRNA = mehrere Funktionen werden gekoppelt
- Prokaryoten haben ein zirkuläres Genom = Replikation und Transkription
- Prokaryoten: Multiple translation start site mit verschiedenen Regulatoren
- Eukaryoten: 1 Gen und 1 Transkript und 1 Protein = single translation start site
- Transkriptionsfaktoren sind bei Eukaryoten wichtiger als bei Prokaryoten
- Eukaryoten haben mehrere Binderegionen für Transkriptionsfaktoren.
