הנדסת אנזימים

Question 1

כיצד גילו את האספרטיים?

Answer 1

רצו לייצר תרופה לאולקוס. בזמנו חשבו שמדובר בפעילות יתר של פרוטאזות בקיבה שאוכלות את הדופן שלה. רצו לייצר פפטידים שיעכלו את הפרוטאזות בקיבה. בשלב הראשון סינתזו 2 ח”א (אספרטיים) וגילו שהוא מאוד מתוק- פי 200 מסוכר

Question 2

ממה מורכב אספרטיים ומדוע אינו מתאים לאפייה?

Answer 2

הטעם המתוק של אספרטיים נוצר מאננטיומר L של אספרטט ופנילאלאנין. הצד הקרבוקסילי של פנילאלאנין צריך להיות מתיל אסטר, והצד האמיני צריך להיות חסום כדי שנקבל קישור דרך החלק הקרבוקסילי.
אספרטיים מיועד למשקאות דיאטטיים ומסטיקים אבל לא לאפייה – כי יש שם מתיל שמתפרק באפייה ויוצר אתנול.

Question 3

איזה אנזים תרמופילי יכול להוביל את כיוון הריאקציה ליצירת קשר פפטידי של אספרטיים (במקום פירוק)

Answer 3

תרמוליזין. ניתן להעלות את טמפ’ הריאקציה שתתאים לאנזים, ולהוריד את ריכוז המים (כי יצירת קשר פפטידי מייצרת מולק’ מים ואנחנו רוצים לעודד כיוון זה של הריאקציה) ובכך להגביר את כיוון יצירת הקשר הפפטידי ע”י האנזים

Question 4

כיצד אי-קולי יכול להגביר את יצירת האספרטט-L (המשמש ביצירת אספרטיים)?

Answer 4

לאי-קולי יש אנזים שנקרא אספרטאז שלוקח אמוניה וחומצה פומארית (ולהפך, בש”מ) והופך את לחומצה אספרטית L

Question 5

כיצד ניתן להגביר את ייצור הדי-אצטיל במסלול פירוק הלקטוז ע”י חיידקים לקטיים

Answer 5

• ניתן לעכב או לפגוע באנזים לקטאט דהידרוגנאז שהופך פירובט לחומצה לקטית כדי שיותר פירובט ילך לכיוון של יצירת אלפא אצטולקטאט -> ומשם לדי-אצטיל (בעזרת ODC)
• ניתן לעשות נוקאאוט גם לגנים של אנזימים בתהליכים אחרים שנגזרים מפירובט
• ניתן לקחת אנזים Nox שמייצר מים מחמצן אטמוספרי ו-NADH ובכך לייצר NAD+ ביתר, שיעכב את הריאקציות האחרות שנגזרות מפירובט
• אפשר לעשות נוקאאוט לאנזים adr שהופך דיאצטיל לאצטואין, כדי שיצטבר לנו דיאצטיל

Question 6

מה ההבדל בין הגישות rational design ו-random approaches בהנדסת אנזימים?

Answer 6

Rational design – בודקים איזה שינוי יביא לתוצאה הרצויה.
יש לדעת איך נראה האתר הפעיל וכל האנזים, צריך שיהיה מודל של האנזים, לדעת אילו בקרות עובדות עליו, להכיר את המנגנון הקטליטי. בקיצור לדעת כמה שיותר.
Random approaches – אבולוציה במבחנה (שינויים לא נקודתיים). לא צריך לדעת יותר מידי, פשוט רואים שזה עובד. הבעיה היא שיש ספרייה ענקית שצריך לברור מתוכה.
* יש גם שיטה שמשלבת בין השתיים.
אם נוכל לבנות מערכת סלקציה טובה, הגישה הרנדומלית (אבולוציה במבחנה) תהיה תמיד עדיפה על הגישה הרציונלית, כי אנחנו לא באמת יודעים את התהליכים וכאן אין את מגבלת הבנת המודל. הדברים “קורים מעצמם” ואנחנו רק צריכים לסנן את התופעות הרצויות.

Question 7

אילו סוגים של קיבוע של אנזים יש?

Answer 7

קישור של האנזים למצע (מטריקס):

1. ספיחה פיזית של אנזים למצע באמצעות קשר חלש (קשירה לפי מטען חיובי/שלילי, או נוגדן על המצע שנקשר לאנזים) כדי לא לפגוע בפעילות האנזים
2. צילוב באמצעות קשר קוולנטי - משתמשים בריאגנט שמגיב עם המצע והאנזים. כדי שהאנזים לא יותר מדי יתפרש על המצע ופעילותו תפגע, יש לכייל את הקשירה

לכידה של האנזים בקפסולה מולקולרית:

1. לכידה של האנזים בתוך מטריקס כמו אגרוז (אך יש דיפוזיה איטית המקשרת בין הסובסטרט/תוצר למצע היא איטית)
2. מיקרואנקפסולציה - יצירה של תלכיד (פולימר) שבנוי כרשת כך שהסובסטרט והתוצר יעברו אך האנזים לא (מתאים לאנזימים יקרים שצריך למחזר)