Western Blotting / Imumunoblotting

Question 1

Western Blotting - O que é?

Answer 1

Associação de técnica de Eletroforese em Gel de SDS-PAGE com técnicas imunológicas

Question 2

Definições

Blotting → ?

Immunoblot → ?

Answer 2

Definições

Blotting → eletrotransferência para membrana de nitrocelulose

Immunoblot → interação Ag-Ac na membrana

Question 3

Western Blotting - Função

Answer 3

Técnica utilizada como teste confirmatório de técnicas com alta sensibilidade (como ELISA)

Question 4

Especificidade vs Sensibilidade

Western → ?

ELISA → ?

Answer 4

Especificidade vs Sensibilidade

Western → mais específico que sensível

ELISA → mais sensível que específico

Question 5

Western Blotting - Porque é mais específico?

Answer 5

Permite a identificação do reconhecimento de Ags com peso molecular definido

Question 6

Identificação da reatividade específica de anticorpos detectados por um teste de triagem utilizando múltiplas frações antigênicas

Answer 6

Identificação da reatividade específica de anticorpos detectados por um teste de triagem utilizando múltiplas frações antigênicas

Question 7

Banco de Sangue

Answer 7

NAT

ELISA (2 metodologias diferentes)

Quando ELISA da Positivo → confirmação com teste + específico → Western Blotting

Question 8

Western Blotting - Procedimento 3

Answer 8

Fração Ag → tratada para fazer corrida eletroforética

Eletroforese em gel → e Eletrotransferência membrana de NC

Após a transferência → imunoblotting

Question 9

WB - Tratamento prévio das proteínas para dissociá-las: 6/*

Answer 9

EDTA

Uréia

SDS

Mercaptoetanol

Tewn 20

Fervura

*a depender da técnica utilizada

Question 10

Duração

Corrida → ?

Transferência → ?

Answer 10

Duração

Corrida → 4-5h

Transferência → 18h

Question 11

WB - Após a transferência → imunoblotting: 6

Answer 11

Como ELISA direto → já temos Ag na membrana de nitrocelulose

Passos ↑

Adc Amostra Ac

Adc Conjugado (Ac Marcado com Enzima)

Adc Substrato Cromogênico

Leitura

Question 12

Western Blotting - Vantagens 4

Answer 12

Alta Sensibilidade e Especificidade

Reconhecimento de Ags individuais em um extrato

Realização de perfil de reconhecimento de antígenos

Determinação de proteínas imunodominantes

Question 13

Western Blotting - Desvantagens 3

Answer 13

Custo Médio a Alto (tudo envolvendo BioMol é caro)

Procedimento Longo e Propenso a Erros em Diversos Pontos (Teste Manual → passível de erros técnicos)

Dependendo do Sistema de Revelação → pode-se ter problemas de segurança.

Question 14

Immunoblotting - O que ocorre? 2

Answer 14

Conjugado (Ac Marcado com Enzima) → reconhece Ac Original e se liga

Após lavagem → adc Substrato Cromogênico permite visualização do Ac 2º